目的: 破伤风是由破伤风杆菌侵入机体后引起的一种急性感染性疾病,主要是由破伤风杆菌产生的外毒素侵袭神经系统而导致的。目前唯一有效的防治手段是及时注射精制破伤风抗毒素(TAT)或人破伤风免疫球蛋白(TIG),以中和血液中游离的毒素。但由于TAT存在过敏反应,而TIG血液来源困难并存在病原微生物污染等问题,使临床应用上受到了很大的限制。近年来随着噬菌体抗体库技术的建立和发展,使人源抗体的制备成为可能,从而可以在根本上解决了过敏反应、血液不足及病原微生物污染等问题。本论文利用此免疫噬菌体抗体库技术,探索制备人抗破伤风类毒素的抗体。从破伤风类毒素免疫的个体获得人Fab抗体基因,构建人Fab抗体基因库;用破伤风外毒素筛选出展示人源TAT-Fab抗体噬菌体;挑选一株在大肠杆菌中表达可溶性人源TAT-Fab抗体,并初步鉴定所制备的可溶性人源TAT-Fab抗体具有部分中和破伤风外毒素的生物活性。 方法: 1.自破伤风类毒素加强免疫者的外周血中分离单个核细胞(PBMC),提取细胞总RNA并反转录合成cDNA;以cDNA为模板,用PCR法扩增全套人Ig轻链(κ链、λ链)基因和重链(γ链)Fd段基因。 2.自含有噬菌粒pComb3的大肠杆菌XL1-Blue中抽提并纯化载体pComb3。 3.XbaI和SacI双酶切混合轻链基因和噬菌粒pComb3,并从凝胶中回收纯化。T4 DNA连接酶连接上述双酶切产物,电穿孔转染大肠杆菌XL1-Blue,构建人Ig轻链基因库(pComb3-L)。XbaI和XhoI双酶切鉴定。 4.抽提纯化人Ig轻链基因库的重组噬菌粒(pComb3-L),与混合重链Fd段基因均XhoI和SpeI双酶切,并从凝胶中回收纯化。T4 DNA连接酶连接上述双酶切产物,电穿孔转染大肠杆菌XL1-Blue,构建人Fab抗体基因库(pComb3-HL)。XbaI和XhoI双酶切鉴定。