应激是机体受到内外环境因素刺激时表现出的非特异性神经-内分泌-免疫反应,高强度应激可损伤神经突触可塑性和认知功能。N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体是介导突触可塑性和认知功能的一类重要的谷氨酸受体。关于NMDA受体在应激致突触可塑性和认知功能损伤时发挥什么样的作用,有关研究报道尚存在较多矛盾。有研究报道NMDA受体过度激活是应激致突触可塑性和认知功能障碍的重要因素,然而另一些研究则提示应激时NMDA功能是降低的。因此,本研究首先探究了 NMDA受体过度激活还是功能不足参与应激所致突触可塑性和认知功能损伤;在此基础上,观察了 D-serine（NMDA受体共激活分子）代谢通路在应激所致NMDA受体功能异常中的作用;最后从天然化合物筛选得到了可改善应激致突触可塑性损伤的化合物297,并进一步考察了调节NMDA受体功能和D-serine代谢通路在其改善应激所致情绪障碍和认知功能损伤作用。第一章NMDA受体在应激致突触可塑性和认知功能损伤中的作用及机制突触可塑性是学习记忆的神经生物学基础,被广泛地应用于学习记忆功能的相关研究,长时程突触功能可塑性主要包括长时程增强（Long-term potentiation,LTP）和长时程抑制（Long-term depression,LTD）。本研究首先建立多种急性（单次注射皮质酮和单次束缚应激）和慢性（连续21天注射皮质酮和连续21天束缚应激）应激模型,采用在体电生理实验,以群峰电位（Population spike,PS）为指标记录小鼠海马突触可塑性（LTP和LTD）变化,采用新物体识别实验、新位置识别实验和筑巢实验等评价小鼠认知功能,观察急、慢性应激对小鼠海马突触可塑性和认知功能的影响。随后采用NMDA受体拮抗剂或共激动剂,抑制或增强NMDA受体功能,观察对小鼠海马LTP的影响,从而探讨NMDA受体过度激活还是功能不足参与应激所致突触可塑性和认知功能损伤。最后,采用高相液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）测定 D-Serine 等神经递质水平、采用蛋白免疫印迹（Western Blots,WB）测定NMDA受体等蛋白表达,以探讨NMDA受体及其相关D-serine代谢通路在应激致NMDA受体功能异常中的作用。一、应激对小鼠海马突触可塑性和认知功能的影响在体电生理实验结果表明,急性应激（单次注射皮质酮和单次束缚）和慢性应激（连续21天注射皮质酮和连续21天束缚应激）均可显著损伤小鼠海马LTP;急性应激（单次注射皮质酮）可显著损伤小鼠海马LTD。位置和物体识别实验结果表明,单次注射皮质酮后小鼠位置辨识指数显著降低,连续21天注射皮质酮或连续21天束缚后小鼠的物体辨识指数均显著降低,提示急、慢性应激均可显著损伤小鼠的识别记忆。筑巢实验结果表明,连续21天注射皮质酮后小鼠筑巢得分显著降低,提示慢性应激可显著损伤小鼠的筑巢能力。皮质酮测定结果表明,单次和连续21天注射皮质酮后小鼠血清皮质酮水平均显著升高,与文献报道采用行为应激所引起的皮质酮升高水平一致。以上研究结果表明,急、慢性应激均可显著损伤小鼠海马突触可塑性和认知功能。后续实验采用单次注射皮质酮模拟急性应激,采用连续21天注射皮质酮模拟慢性应激,观察急、慢性应激对NMDA受体功能的影响及机制。二、皮质酮应激对海马NMDA受体功能的影响本部分实验采用皮质酮模型,通过使用NMDA受体拮抗剂或共激动剂,抑制或增强NMDA受体功能,观察其对小鼠海马LTP的影响,从而探讨NMDA受体过度激活还是功能不足参与了应激所致突触可塑性和认知功能损伤。结果表明,单次和连续21天注射皮质酮后海马谷氨酸水平较正常小鼠均显著升高,提示其可能过度激活NMDA受体,介导兴奋性毒性。为了确证此推测,我们首先观察了采用NMDA受体拮抗剂D-AP5、选择性GluN2A拮抗剂PEAQX和选择性GluN2B拮抗剂Ro25-6981降低NMDA的功能,能否改善皮质酮所致LTP损伤。结果表明,D-AP5、PEAQX和Ro25-6981不能改善单次注射皮质酮所致LTP损伤,且有进一步加重连续21天注射皮质酮所致LTP损伤的趋势。上述结果提示,皮质酮应激致神经突触可塑性损伤时,可能不存在海马NMDA受体过度激活。随后,我们观察了采用不同工具药增强NMDA受体功能对皮质酮所致海马LTP损伤的影响。结果表明,侧脑室注射内源性NMDA受体共激动剂D-serine、D-serine的前体L-丝氨酸（L-serine）、NMDA受体共激动剂甘氨酸（Glycine）均可显著改善皮质酮所致海马LTP损伤;可降低内源性D-serine清除的D-氨基酸氧化酶（DAAO）抑制剂MPC也可显著改善皮质酮所致海马LTP损伤;D-serine和MPC对皮质酮所致LTP损伤的改善作用可被NMDA受体甘氨酸位点拮抗剂L-701,324阻断。上述结果提示,皮质酮应激致神经突触可塑性损伤时,海马NMDA受体功能可能是降低的。为了观察皮质酮注射后NMDA受体的两个亚型GluN2A和GluN2B的功能是否均显著降低,我们通过组合使用D-serine和Ro25-6981或PEAQX选择性地增强GluN2A或GluN2B功能对皮质酮所致海马LTP损伤的作用。结果表明,D-serine和Ro25-6981或PEAQX合用均可显著改善皮质酮所致海马LTP损伤,二者的改善作用较单独使用D-serine时具有降低趋势。上述结果提示,皮质酮注射后GluN2A和GluN2B的功能均显著降低。以上研究结果表明,急、慢性应激后小鼠海马NMDA受体功能均显著降低。三、D-serine代谢通路异常在皮质酮致NMDA受体功能不足中的作用本部分实验通过观察NMDA受体的蛋白表达和D-serine代谢通路变化,探究NMDA受体和D-serine代谢通路在应激后NMDA受体功能不足中的作用。单次注射皮质酮后小鼠海马NMDA受体的两个亚型GluN2A和GluN2B的蛋白表达较正常小鼠均无显著变化,连续21天注射皮质酮后小鼠海马GluN2B的蛋白表达较正常小鼠显著升高,GluN2A的蛋白表达较正常小鼠有升高趋势。在D-serine代谢通路中,单次注射皮质酮后小鼠海马D-serine及其前体L-serine的水平、丝氨酸消旋酶（SR）和DAAO的蛋白表达较正常小鼠均无显著变化,但D-serine释放相关的囊泡相关膜蛋白2（VAMP2）和Na+-依赖的丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体-1（ASC-1）的蛋白表达显著降低;采用ASC-1反转运蛋白的选择性激活剂D-异亮氨酸（D-isoleucine）促进D-serine释放可显著改善单次注射皮质酮所致小鼠海马LTP损伤。连续21天注射皮质酮后小鼠海马D-serine含量及其合成SR的蛋白表达较正常小鼠显著降低,L-serine水平、VAMP2、ASC-1和DAAO的蛋白表达较正常小鼠无显著差异。以上研究结果表明,D-serine释放减少可能是急性应激后NMDA受体功能不足的主要原因,而D-serine总体含量降低可能是慢性应激后NMDA受体功能不足的主要原因。第二章NMDA受体在钩藤源生物碱297改善应激致认知损伤中的作用研究目前以抗抑郁药为主药物治疗能够部分改善应激引起的情绪障碍,但对认知功能损伤没有显著改善作用。因此,急需开发可同时改善应激所致情绪障碍和认知功能损伤的药物。研究发现钩藤源生物碱不仅能够改善多种原因所致的认知功能损伤,还具有抗抑郁作用;提示钩藤源生物碱可能成为潜在的抗应激药物。我们的电生理实验结果表明,钩藤源生物碱297可同时改善皮质酮所致LTP和LTD损伤,但297是否能够改善应激所致情绪障碍和认知功能损伤,其对NMDA受体功能和D-serine代谢通路是否存在调节作均尚不清楚。本研究采用28天慢性不可预知温和应激（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）模型,造模前一周开始分别灌胃给予20 mg/kg的297及其同分异构体315和对照药物氟西汀,采用转棒实验评价小鼠的体力,旷场实验和高架十字迷宫评价小鼠的焦虑样行为,糖水偏好实验评价小鼠的抑郁样行为;新物体识别实验和Morris水迷宫实验评价小鼠的学习记忆功能;采用HPLC测定D-Serine等神经递质水平、WB测定NMDA受体等蛋白表达;以探究297能否改善CUMS所致情绪障碍和认知功能损伤及调节NMDA受体功能和D-serine代谢通路。一、天然来源化合物对皮质酮致海马突触可塑性损伤的作用在体电生理实验结果表明,单次侧脑室注射297可同时显著改善皮质酮所致小鼠海马LTP和LTD损伤。因此,我们继续观察了 297及其异构体在不同给药方式和剂量下对皮质酮所致LTP损伤的作用。结果表明,单次侧脑室注射297和327均可显著改善皮质酮所致LTP损伤;单次腹腔注射297和315对皮质酮所致LTP损伤具有改善作用;单次灌胃297、315和327对皮质酮所致LTP损伤均具有改善作用;连续七天灌胃297、315、327和307对皮质酮所致LTP损伤均具有改善作用,在给药第7天,327和307组小鼠体重显著降低。上述结果提示,297及其异构体均可改善单次注射皮质酮所致海马LTP损伤,长期给药时327和307可能会产生毒性作用。以上研究结果表明,中枢及外周给予297均可改善皮质酮所致突触可塑性损伤,提示297可能成为潜在的抗应激药物。二、NMDA受体功能在297改善CUMS小鼠认知功能中的作用本部分实验首先观察了 297对CUMS所致情绪障碍和认知功能损伤的作用,随后探究297是否通过调节NMDA受体功能和D-serine代谢通路发挥改善作用。1.297对CUMS小鼠情绪及认知功能的影响结果表明,CUMS小鼠的体重较正常小鼠显著降低,而297则显著减轻了CUMS引起的体重降低,转棒实验结果表明,CUMS小鼠的在棒时间较正常小鼠有降低趋势,297可显著延长CUMS小鼠的在棒时间;提示297可显著改善CUMS所致体重和体力降低。旷场实验结果表明,CUMS小鼠旷场中心区停留时间和进入次数较正常小鼠显著降低,297可显著增加CUMS小鼠旷场中心区停留时间和进入次数,高架十字迷宫实验结果表明,CUMS小鼠开臂停留时间和进入次数较正常小鼠显著降低,297具有增加CUMS小鼠开臂停留时间和进入次数的趋势;提示297可显著改善CUMS所致焦虑样行为。糖水偏好实验结果表明,CUMS引起了小鼠的糖水偏好指数显著降低,297可显著升高CUMS小鼠的糖水偏好指数;提示297可显著改善CUMS所致抑郁样行为。Morris水迷宫实验结果表明,CUMS小鼠的逃避潜伏期增加,穿环次数和目标象限停留时间显著降低;297可显著降低CUMS小鼠的逃避潜伏期,显著增加CUMS小鼠在目标象限的停留时间,具有增加CUMS小鼠穿环次数的趋势;提示297可显著改善CUMS所致空间记忆损伤。上述结果提示,297可同时改善CUMS引起的情绪障碍和认知功能损伤。2.297对CUMS小鼠NMDA受体功能的调节作用血清皮质酮测定结果表明,CUMS小鼠血清皮质酮水平较正常小鼠显著升高,297可显著降低CUMS小鼠血清的皮质酮水平;提示297可以减轻CUMS引起的应激反应。海马谷氨酸测定结果表明,CUMS小鼠海马的谷氨酸水平较正常小鼠显著升高,297可显著降低CUMS小鼠海马谷氨酸水平;CUMS小鼠海马GluN2A和GluN2B的蛋白表达较正常小鼠升高,297可显著降低CUMS小鼠海马GluN2A和GluN2B的蛋白表达;D-serine通路检测结果表明,CUMS小鼠海马D-serine含量及其合成酶SR的蛋白表达较正常小鼠显著降低,297可以显著增加CUMS小鼠海马SR的蛋白表达并促进D-serine的合成。上述结果提示,CUMS可导致NMDA受体表达异常升高,D-serine合成降低;297可恢复CUMS小鼠所致NMDA受体功能和D-serine代谢通路异常。以上研究结果表明,CMUS可造成小鼠情绪障碍和认知功能损伤,并且会导致NMDA功能和D-serine代谢通路异常;297可改善CUMS所致情绪障碍和认知功能损伤,其机制可能与恢复NMDA受体功能和D-serine代谢通路至正常水平有关。综上所述,本研究主要结论如下:1.急性和慢性应激均可显著损伤小鼠海马突触可塑性和认知功能,且可能与NMDA受体功能不足有关,而不是与受体过度激活有关。2.D-serine代谢通路异常参与皮质酮所致NMDA受体功能不足,急性应激主要表现为D-serine释放降低,而慢性应激主要表现为D-serine含量降低。调节D-serine 代谢通路异常所致NMDA受体功能不足可能是防治应激所致认知功能损伤的有效干预策略。3.化合物297可显著改善皮质酮所致海马突触可塑性损伤,并显著改善CUMS所致情绪障碍和认知功能损伤;上述作用可能与其调节NMDA受体功能和D-serine代谢通路有关。提示297可能成为潜在的抗应激药物。