气单胞菌不仅是一类重要的人畜共患致病菌,也是水产动物的主要致病菌。气单胞菌疾病严重制约着水产养殖业的健康发展。抗生素作为控制疾病的药物,因存在耐药性和药物残留等弊端,其使用越来越受到限制。为寻找抗生素替代品和预防水产动物疾病爆发,益生菌已成为最有潜力的替代品。本文通过病原分离的方法确定致病菌;然后研究致病菌对宿主免疫指标和免疫相关基因的影响;同时为防治疾病爆发,开展益生菌的筛选及其效果研究。主要研究内容和结果如下:1.罗非鱼舒伯特气单胞菌的分离及鉴定2017年9月至10月海南省海口市半咸水湖泊中的罗非鱼爆发疾病。为确定本次疾病爆发的原因,从患病罗非鱼中分离得到4株优势菌(ASL-1、ASB-2、ASB-3和ASS-4菌株)。人工回归感染试验显示,ASS-4菌株毒性最强且7天半致死浓度为4.91×10~4CFU/g。经生理生化和分子鉴定(16S rDNA、ela、dnaJ和gyrB)表明4株优势菌均为舒伯特气单胞菌。ASS-4菌株的不同感染途径试验显示,累计死亡率从高到低为腹腔注射>肌肉注射>口服>浸泡。2.舒伯特气单胞菌对罗非鱼免疫指标和免疫相关基因的影响利用舒伯特气单胞菌(ASS-4)腹腔注射感染罗非鱼,研究不同感染时间点(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和168 h)免疫指标和免疫相关基因表达的差异性。结果显示,ASS-4菌株在早期阶段可以刺激罗非鱼的抗氧化活性(SOD、GSH-PX和MAD)和非特异免疫活性(RB、ACP、AKP和LZM)。通过RT-qPCR技术检测发现罗非鱼肠道和头肾组织中免疫相关基因(COX-2、TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10和HSP70)转录均被激活。3.罗非鱼肠道益生菌的筛选鉴定及益生特性评价本研究为筛选拮抗舒伯特气单胞菌的潜在益生菌,利用LB和MRS琼脂培养基,从罗非鱼肠道中分离培养得到414株菌。通过测定菌株的溶血、胞外酶和拮抗舒伯特气单胞菌活性,从中筛选得到4株潜在益生菌。通过评价潜在益生菌的人工胃肠液耐受性和生物表面被膜形成能力等,确定G45菌株为后续试验的潜在益生菌。经生理生化和16S rDNA鉴定,G45菌株为贝莱斯芽孢杆菌。4.贝莱斯芽孢杆菌对罗非鱼的影响为研究贝莱斯芽孢杆菌(G45)对罗非鱼的益生作用,将G45菌株和植物乳杆菌(1036菌株和58菌株)拌料连续投喂罗非鱼10周。结果显示,G45菌株能够显著提高罗非鱼的生长性能、抗氧化活性和非特异性免疫活性。免疫相关基因结果显示,G45菌株可以提高COX-2、TGF-β、IL-10和HSP70相对表达,降低TNF-α和IL-1β相对表达。舒伯特气单胞菌感染试验显示,G45组的死亡率显著低于对照组。