研究背景：　　近年来，青春期发育时间呈提前趋势。这一现象引起了科学家们的广泛关注。来自全球不同地区（比如欧洲、美国和中国）的多项研究结果显示，青春期儿童第二性征出现的年龄呈提前趋势。由于青春期阶段涉及到全身多个系统的发育，所以其发育时间的改变可能与成年后机体的健康状态有关。有研究显示，青春期发育延迟与成年后精液质量下降存在关联。Kiss1/GPR54 系统是近年来发现的下丘脑-垂体-性腺轴的重要调控系统。研究表明，该系统处于下丘脑-垂体-性腺轴的上游，kiss1编码的分泌型蛋白kisspeptin可以与下丘脑GnRH神经元上的GPR54受体结合，促进GnRH的分泌，从而调控下游性激素的合成分泌、青春期发育以及生殖功能。Kiss1或GPR54基因突变会导致个体发生低促性腺激素性腺功能减退。同时，GPR54基因敲除的动物无法进入青春期，睾丸体积不会增长，而给予外源性kisspeptin后，血清LH、睾酮开始增加，动物进入青春期。此外，kiss1/GPR54 系统是环境内分泌干扰物的重要作用靶点，该系统可能介导了环境内分泌干扰物导致的生殖系统损伤。　　近年来，男性生殖健康问题越来越突出，大量文献报道了精液质量的下降趋势。2017年的一篇荟萃分析指出，在过去 40 年的时间内，西方国家的男性精子密度平均每年下降 1.4%，精子总数平均每年下降 1.6%。精液质量受到遗传、环境、社会-心理-行为等多方面因素的共同影响，其中环境内分泌干扰物是非常重要的有害因素之一。邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类环境内分泌干扰物的统称。它们在工业生产中应用非常广泛。高分子量的PAEs类化合物可以作为增塑剂，而低分子量的PAEs类化合物可以用于个人洗护用品或药品等。到目前为止，大量PAEs类化合物被排放到我们的生活环境中，它们通过呼吸、消化、皮肤等途径进入人体。邻苯二甲酸二乙基己酯（Di (2-Ethylhexyl) Phthalate, DEHP）是一种邻苯二甲酸酯类化合物的代表物，在聚氯乙烯（polyvinyl chloride, PVC）中应用广泛，俗称塑化剂。很多流行病学和实验室研究表明，DEHP暴露与男性生殖健康损伤密切相关，比如精液质量下降、激素水平改变等。很多研究显示，睾丸间质细胞是DEHP的靶细胞之一。DEHP具有抗雄激素作用，它可以抑制睾酮的生成，并干扰其发挥正常功能。然而，也有部分研究显示，低剂量DEHP具有促进睾酮分泌的作用。相关研究的差异可能主要是由DEHP暴露时间和暴露剂量造成的，所以DEHP对睾酮可能具有双相调节效应。DEHP可以通过多种途径引起生殖系统损伤。一方面，DEHP及其代谢产物可以直接作用于生殖系统。另一方面，DEHP还可以通过影响下丘脑-垂体-性腺轴的功能，间接影响生殖系统的功能。　　因此，本课题基于重庆市大学生男性生殖健康队列研究，同时通过构建青春期前低剂量DEHP染毒动物模型，研究了青春期发育时间、精浆中kisspeptin浓度与精液质量之间的关系，探索了kiss1/GPR54系统在DEHP致男（雄）性生殖毒性中的作用及机制。　　研究内容：　　1.青春期发育时间与精液质量之间的关联研究　　在重庆市大学生男性生殖健康队列基线调查（2013年）中，纳入680名合格志愿者。志愿者完成了生殖健康调查问卷，内容包括青春期发育时间问卷以及个人信息、健康状态、生活方式等方面的信息。每名志愿者提供1份精液样本进行精液常规和精子染色质结构分析，和1份血液样本进行血清性激素检测。通过多元线性回归分析了青春期发育时间与精液参数、性激素之间的关联，其中校正了年龄、禁欲时间等混杂因素。　　2. 精浆中kisspeptin浓度与精液质量之间的关联研究　　在重庆市大学生男性生殖健康队列研究第一次随访（2014年）中，纳入666名合格志愿者。通过生殖健康调查问卷获得健康状态、禁欲时间和生活方式等方面的信息，每名志愿者都提供了血液和精液样本。通过ELISA法检测了血浆和精浆中kisspeptin浓度，通过计算机辅助精子分析系统 (Computer-Aided Sperm Analysis, CASA）(Microptic S.L., Barcelona,西班牙)进行精液常规检测。Total kisspeptin＝精浆kisspeptin浓度×精液量。我们采用Spearman相关分析了血浆kisspeptin、精浆kisspeptin、total kisspeptin和精液常规之间的关系，而后采用多元线性回归进一步分析精浆kisspeptin、total kisspeptin与精液常规之间的关系。　　3. Kiss1/GPR54系统在青春期前低剂量DEHP暴露致睾酮升高中的作用和机制研究　　建立了青春期前低剂量DEHP暴露雄性大鼠模型。从P26天到P70天监测大鼠的体重和肛殖距，记录每一只动物的包皮分离天数来反映青春期发育时间。雄性大鼠达到性成熟后（P70天）进行以下检测：首先取附睾精子进行精液常规检测；采用HE染色观察睾丸组织的病理学形态；采用免疫组化检测睾丸组织PCNA的表达情况，反映细胞增殖；第二、采用放射免疫法检测血清中E2、T、LH、FSH浓度。进一步通过Western Blot检测了睾丸中睾酮生成的关键调控蛋白（3β-HSD、17β-HSD、CYP11A1、StAR、LHCGR）的表达；第三、采用 ELISA 法检测了血清中 kisspeptin 浓度；第四、检测了下丘脑kiss1/GPR54系统的表达。采用免疫组化法检测了下丘脑AVPV区和ARC区kisspeptin的表达；采用RT-qPCR法检测下丘脑与kiss1共表达的相关基因（kiss1R、NKB、Pdyn）表达情况；又进一步通过 RT-qPCR 法检测了下丘脑雄激素受体和雌激素受体的表达情况；第五、通过Western Blot和RT-qPCR检测睾丸中kiss1和它的受体GPR54的表达。　　4. Kisspeptin对精子胞内[Ca2+]浓度和睾丸间质细胞合成睾酮能力的影响　　分别通过雄性SD大鼠附睾中分离精子和手淫法获得志愿者精液样本。用含1 uM Fluo-4 AM（[Ca2+]荧光探针）的培养基孵育精子，而后采用不同浓度的kisspeptin（kp10）和 GPR54 受体拮抗剂（kp234）处理精子，采用荧光分光光度仪检测精子胞内[Ca2+]浓度。采用计算机辅助精子分析系统，检测不同浓度的kp10和kp234对精子活力的影响。分离原代大鼠睾丸间质细胞，并采用3β-HSD染色法鉴定其纯度，采用不同浓度的kp10和kp234处理睾丸间质细胞4 h和12 h后，采用ELISA法检测培养基中睾酮的浓度。　　研究结果：　　1.青春期发育时间与精液参数、性激素之间的关联分析　　此次调查一共纳入了680名合格志愿者。首先，通过青春期发育时间问卷调查了青春期事件（身高开始快速增长、体毛发育、初次遗精、身高增长最快、声音变低变粗、皮肤油腻毛孔增粗和胡须出现）发生的年龄。本人群中的青春期事件发生的年龄在13.04岁到15.37岁之间，与国内相关研究的结果一致。其次，采用多元线性回归分析青春期发育时间与精液参数、性激素之间的关系。校正年龄、禁欲时间等混杂因素后，身高增长最快的年龄与精子密度呈正相关关系（% change = 4.7, 95% CI: 1.0~8.6），与精子正常形态率呈正相关关系（% change = 2.1, 95% CI: 0.3~4.0）。初次遗精的年龄与精子密度呈正相关关系（% change = 6.4, 95% CI: 1.7~11.3），与精液量呈负相关关系（% change = -2.9, 95% CI: -5.5~-0.3）。再次，由于BMI和睾丸体积可能是二者关联的中介因素，所以我们对BMI和睾丸体积分别进行了额外校正。结果显示，对BMI和睾丸体积进行额外校正并没有减弱青春期发育时间与精液质量之间的关联。此外，身高开始增长的年龄和身高增长最快的年龄每晚1岁，血清E2水平分别下降6.5%（95% CI: -9.8~-3.0）和6.7%（95% CI: -10.4~-2.8）。而身高开始增长的年龄每晚1岁，血清FSH水平增加2.6%（95% CI: 0.2~4.7）。最后，按照身高增长最快年龄的四分位数将志愿者分为4组。青春期发育最晚的组较青春期发育最早的组精子密度升高了20.8%（95% CI: 2.1~42.9），血清E2浓度下降了22.4%（95% CI: -34.7~-7.7）。　　2. 精浆中kisspeptin浓度与精液质量之间的关联研究　　此次调查一共纳入666名合格志愿者。血浆中kisspeptin浓度在9.0 pg/m-2133.7pg/ml之间，而精浆中kisspeptin浓度在2 ug/ml-532 ug/ml之间。精浆中kisspeptin浓度（28×106 pg/ml）是血浆中kisspeptin浓度（448.9 pg/ml）的60000倍。Spearman相关分析的结果显示：血浆中kisspeptin与精液常规之间没有统计学关联，精浆kisspeptin与精子密度呈正相关关系（r= 0.124,P= 0.002），与精液量呈负相关关系（r＝-0.104，P= 0.009）。Total kisspeptin与精液量和精子总数呈正相关关系，Spearman相关系数分别是0.332和0.230（P= 0.000和0.000）。校正了年龄、禁欲时间、BMI等级和吸烟4项混杂因素后，多元线性回归分析结果显示：精浆中 kisspeptin 浓度与精子密度呈正相关关系。精浆中kisspeptin浓度每升高34 ug/ml（四分位间距），精子密度升高4.6%（95% CI: 1.6~7.6， P= 0.003）。精浆中kisspeptin浓度与精子总数也呈正相关关系。精浆中kisspeptin浓度每升高34 ug/ml（四分位间距），精子总数升高3.3%（95% CI: 0.0~6.5，P= 0.047）。此外，我们发现Total kisspeptin与精液量呈正相关关系。Total kisspeptin每升高136.8 ug （四分位间距），精液量升高5.3% (95% CI: 3.6~6.9，P= 0.000)。Total kisspeptin与精子总数呈正相关关系。Total kisspeptin每升高136.8 ug（四分位间距），精子总数上升7.7% (95% CI: 4.4~11.0,P= 0.000)。根据四分位数将精浆中kisspeptin浓度和Total kisspeptin等分为4组，精浆中kisspeptin浓度最高组较最低组的精子密度升高了24.6% (95% CI: 6.3~46.0)。Total kisspeptin最高组较最低组的精液量升高了35.8% (95% CI: 25.2~47.3)，精子总数升高了57.5% (95% CI: 33.2~86.2)。　　3. Kiss1/GPR54系统在青春期前低剂量DEHP暴露致睾酮升高中的作用和机制研究　　青春期前低剂量DEHP暴露对雄性SD大鼠体重和肛殖距无影响，导致青春期发育时间提前，血清睾酮水平上升。睾丸间质细胞3β-HSD、17β-HSD和StAR蛋白表达上调，说明DEHP暴露导致的血清睾酮水平上升与间质细胞睾酮合成关键调控蛋白表达上调有关。DEHP染毒导致下丘脑kisspeptin蛋白表达下降，与kisspeptin共表达的NKB和kiss1R基因表达下调，Pdyn基因表达上调，说明DEHP染毒导致下丘脑kiss1/GPR54系统受到抑制。我们进一步分析发现，下丘脑雄激素受体（AR）发生上调，睾酮可能通过AR的负反馈作用对kisspeptin产生抑制作用。雌激素受体（ERα和ERβ）在AVPV区表达下调，使AVPV区对kisspeptin的正反馈作用下降。而雌激素受体（ERα和ERβ）在ARC区表达上调，使ARC区对kisspeptin的负反馈作用增强。　　4. Kiss1/GPR54系统对精子胞内[Ca2+]浓度和睾丸间质细胞合成睾酮能力的影响　　体外培养人类精子发现，精子具有分泌kisspeptin的能力。外源性kp10对人类精子胞内[Ca2+]浓度没有影响，而GPR54受体拮抗剂kp234可以引起人类精子胞内[Ca2+]浓度下降。然而动物实验研究显示：Kp10可以促进大鼠精子胞内[Ca2+]浓度升高，而且呈剂量-反应关系。此外，免疫组化结果显示，GPR54受体在大鼠睾丸间质细胞中高表达，但是kp10和kp234对原代大鼠睾丸间质细胞睾酮合成能力没有影响。　　研究结论：　　1. 重庆市大学生男性生殖健康队列研究发现，青春期发育时间与精液质量呈正相关关系，精浆中 kisspeptin 与精子密度、精子总数呈正相关关系。以上结果提示：青春期发育提前可能是生殖健康损害的标志，kisspeptin 可能在精子发生、精子功能调控中发挥了重要作用，kisspeptin可能是精液质量的潜在生物标志物。　　2.我们进一步通过动物实验研究发现，青春期前低剂量DEHP暴露影响了下丘脑-垂体-性腺轴的激素调节平衡，DEHP暴露导致睾丸间质细胞睾酮生成的关键调控蛋白表达上升，促使大鼠血清睾酮水平升高，睾酮的升高反过来通过下丘脑的雄激素受体对kiss1/GPR54 系统产生抑制作用。Kiss1/GPR54 系统下调进一步促使睾丸间质细胞的睾酮合成增加。因此，kiss1/GPR54系统可能介导了低剂量DEHP暴露对睾酮的刺激效应。　　3.外源性kisspeptin或kp234处理体外分离培养人和大鼠的精子可以影响精子胞内[Ca2+]浓度，提示kiss1/GPR54系统可能通过调控精子胞内[Ca2+]的浓度参与精子活力、精子超活化以及精卵结合等过程。　　因此，青春期提前和kiss1/GPR54系统在男（雄）性生殖损害中发挥了非常重要的作用。