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骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是干细胞家族的主要成员,其最初在骨髓被发现,它具有多项功能诸如,分化潜能,造血支持,免疫调节等。其增殖和分化为现如今的热点。在1999年,Ghrelin被日本学者Kojima等发现。经研究发现,它是由28个氨基酸残基组成,分子量为3.3KD。Ghrelin是生长激素促分泌素受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的内源性配体,当它与其受体GHS-R结合后会产生具有很强的促进生长激素(Growth hormone,GH)释放的作用。对MAPK途径的研究主要表现在哺乳动物细胞中的研究,其主要方法是过表达、失活、基因沉默等方法。MAPK信号通路主要有4种类型,用它们的核心命名为MAPK。多种生理活动的调节均由其参与。每条通路都可以和其它通路相整合交叉,细胞的命运主要由他们的信号强弱及活化程度决定。目的:本研究就ghrelin对兔BMSCs(rBMSCs)的增殖与分化的作用,及ghrelin通过哪种途径来实现对兔BMSCs的增殖与分化的作用机制进行研究。方法:从健康清洁新西兰大白兔体内分离纯化得到rBMSCs。传代后免疫荧光检测rMSCs细胞标记物CD44、CD34的表达,用MTT检测不同代的rmscs在10天内的生长情况,从而得到最佳的生长时间。利用mtt法检测不同浓度的ghrelin对rmscs的增殖作用,从而找到ghrelin对rmscs的增殖作用的最佳的作用浓度与作用时间。用westernblot的方法来检测ghrelin对rmscs不同时间点的mapk通路的关键蛋白(erk1/2,p38和jnk)的磷酸化情况,来研究ghrelin发挥其作用的主要通路。为了进一步研究ghrelin对rmscs增殖的作用,将mapk通路的关键蛋白进行抑制,用westernblot来检测其下游蛋白的磷酸化情况,及细胞增殖情况。同时用ghrelin受体抑制剂作用于细胞,用westernblot方法检mapk通路的关键蛋白(erk1/2,p38和jnk)的磷酸化情况,用mtt法检测细胞增殖情况。同时用ghrelin对rbmcs向成骨细胞分化的影响进行研究。用westernblot检测加入ghrelin后成骨细胞标志因子alp,runx2和osterix的表达情况,同时检测mapk通路的关键蛋白(erk1/2,p38和jnk)的磷酸化情况,来确定ghrelin对rbmcs向成骨细胞分化影响的作用机制。用mapk通路的关键蛋白的抑制剂作用于细胞,及ghrelin受体抑制剂作用于rbmcs向成骨细胞分化的过程,在分别检测alp,runx2和osterix的表达情况。结果:由新西兰大白兔提rmscs,经培养得到较纯的细胞,其在第四代的生长最佳,且cd44有强烈表达,而cd34则没有表达。ghrelin对rmscs有明显的促进生长的作用。ghrelin对rmscs的最佳作用浓度为600ng/ml,作用时间为第三天。用600ng/ml的ghrelin作用于rbmcs并于0,20,40和60min后,磷酸化的erk1/2的表达量在ghrelin作用后随着作用时间的增加而增加(p<0.05)。且在40min时达到量高而后保持不变(p<0.05)。说明ghrelin对rbmcs的作用是通过erk1/2通路起作用的。为了进一步证明erk1/2通路的做用,用erk1/2磷酸化抑制剂u0126作用细胞,发现ghrelin对细胞的促进生长作用消失。当细胞在600ng/mlghrelin的作用下,加入ghrelin受体抑制剂,抑制了细胞的生长。从而说明在ghrelin促进rmscs生长增殖时也是ghrelin首先与其受体结合然后才发挥的促进作用的。在本研究中将alp,runx2和osterix作为rbmscs向成骨细胞分化的检测指标,结果表明在ghrelin存在的情况下,alp,runx2和osterix的表达量升高,更有利于rbmscs向成骨细胞分化。为了进一步研究ghrelin促进rbmscs向成骨细胞分化的作用机制,本研究对mapk通路的主要蛋白erk1/2,jnk和p38磷酸化情况进行了检测。结果表明ghrelin促进rbmscs向成骨细胞分化主要是通过erk1/2通路来实现的,为了进一步证明此机制,我们用erk1/2磷酸化抑制剂u0126作用于rbmscs,结果表明erk1/2磷酸化被抑制,而alp,runx2和osterix这三种蛋白的表达量均显著下降,且低于只加地塞米松组的表达量,说明rbmscs向成骨细胞分化过程减慢。进一步证明了ghrelin促进rbmscs向成骨细胞分化主要是通过erk1/2通路来实现的。为了证明ghrelin促进rbmscs向成骨细胞分化的实现是ghrelin先与其受体结合然后才发挥其作用的,本研究还用ghrelin受体抑制剂作用于rbmscs后磷酸化的erk1/2,jnk,p38的表达量在不同的时间段均没有发生明显的变化。同时检测了细胞中alp,runx2和osterix的表达量也没有变化。表明ghrelin的促进作用受到抑制。结论:本研究证明了ghrelin促进rbmscs向成骨细胞分化的机制是ghrelin先与其受体结合然后通过erk1/2通路促进rbmscs的增殖及向成骨细胞分化的。