缺血预处理是指通过短暂的亚致死性缺血预防随后发生的、更严重的致死性缺血事件的现象。本实验室研究表明,电针（electroacupuncture,EA）能够作为一种非缺血预处理的方式发挥神经保护作用^[1]。近年来,针对EA预处理如何发挥脑保护作用,国内外学者们开展了一系列研究^[2-9],但其确切机制仍有待进一步探讨解析。突触长时程抑制（long-term depression,LTD）参与了脑缺血损伤引起的神经元死亡,并且在体LTD能够模拟缺血预处理诱导的内源性神经保护作用^[10,11]。本实验室千人计划学者张遐教授于2012年发表于Cell的研究证实,外源性大麻素能够在背侧海马（dorsal hippocampus,dHPC）CA1区诱导在体LTD^[12]。而本研究团队发现,EA预处理能够诱导内源性大麻素（endocannabinoid,eCB）增多从而介导脑缺血神经保护作用^[13]。由此我们提出假说,EA预处理通过诱导LTD从而发挥脑保护效应。本研究证实,EA预处理能够诱导dHPC CA3-CA1产生LTD,并且给予CB₁R拮抗剂AM281或基因敲除GABA能神经元CB₁R,均能阻断EA预处理诱导的LTD以及EA诱导的对全脑缺血损伤的神经保护作用。这些结果表明,dHPC CA3-CA1 GABA能神经元CB₁R诱导在体LTD产生介导了EA预处理的脑保护作用,从而对随后的致死性脑缺血损伤产生神经保护作用。实验一EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD【目的】探索EA预处理是否能够诱导dHPC CA3-CA1在体LTD的产生。【方法】雄性成年C57BL/6小鼠随机分为两组:EA组和假EA组,在EA或假EA预处理30 min后,利用在体电生理技术,记录麻醉状态下小鼠dHPC CA3-CA1兴奋性突触后场电位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP）。【结果】结果显示,与基线水平相比,EA预处理30 min诱导dHPC CA3-CA1 fEPSP斜率明显降低并持续>2 h（P<0.05）,即EA预处理诱导了在体LTD的产生,而假EA预处理30 min并没有此效应。【结论】EA预处理能够诱导dHPC CA3-CA1在体LTD产生。实验二EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD介导脑缺血耐受【目的】探索EA预处理诱导的dHPC CA3-CA1在体LTD是否在缺血性脑损伤中介导神经保护作用。【方法】雄性成年C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组,全脑缺血组,EA+全脑缺血组和假EA+全脑缺血组,EA预处理30 min,2 h后进行全脑缺血模型（Global cerebral ischemia,GCI）,全脑缺血20 min后恢复再灌注,72 h后多聚甲醛灌注取脑进行NeuN和FJB染色分别标记活性神经元和变性神经元,计数双侧dHPC CA1区NeuN和FJB阳性细胞数。【结果】NeuN和FJB染色和计数结果显示,EA组与全脑缺血组、假EA+全脑缺血组相比,NeuN阳性的活性神经元的数量明显增多（P<0.01）,而FJB阳性的变性神经元的数量明显减少（P<0.01）。【结论】EA预处理诱导的dHPC CA3-CA1在体LTD介导脑缺血损伤后海马CA1区神经元的缺血耐受。实验三CB₁R拮抗剂AM281阻断EA预处理诱导的dHPC CA3-CA1在体LTD【目的】研究EA预处理诱导的dHPC CA3-CA1在体LTD是否由CB₁R介导产生。【方法】雄性成年C57BL/6小鼠随机分为两组:EA+溶剂组和EA+AM281组,EA前15 min腹腔给予溶剂或AM281,随后EA预处理30 min,EA结束后利用在体电生理技术,记录麻醉状态下小鼠dHPC CA3-CA1 fEPSP。【结果】结果显示,EA预处理30 min诱导的dHPC CA3-CA1的LTD几乎完全被AM281阻断（P<0.05）,而腹腔给予溶剂并不影响EA预处理诱导LTD的产生。【结论】EA预处理通过激活CB₁R诱导dHPC CA3-CA1在体LTD的产生。实验四CB₁R拮抗剂AM281阻断EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD介导的脑缺血耐受【目的】研究CB₁R是否介导EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。【方法】雄性成年C57BL/6小鼠随机分为两组:EA+溶剂组和EA+AM281组,EA预处理30 min,2 h后进行全脑缺血模型,全脑缺血20 min后恢复再灌注,72 h后多聚甲醛灌注取脑进行NeuN和FJB染色分别标记活性神经元和变性神经元,计数双侧dHPC CA1区NeuN和FJB阳性细胞数。【结果】NeuN和FJB染色和计数结果显示,与溶剂组相比,给予AM281后NeuN阳性的活性神经元数量减少（P<0.01）,而FJB阳性的变性神经元的数量增多（P<0.01）,即AM281拮抗CB₁R阻断了EA预处理在缺血性脑损伤中诱导的神经保护作用。【结论】CB₁R参与EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD介导脑缺血损伤后dHPC CA1区神经元的缺血耐受。实验五GABA能神经元CB₁R介导了EA预处理诱导的dHPC CA3-CA1在体LTD【目的】研究各种神经细胞CB₁R介导了EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD的产生。【方法】使用CB₁R-floxed小鼠分别与GAD2-iCreERT2,VGLUT1-iCreERT2和GFAP-CreERT2转基因小鼠杂交,产生三种细胞特异性条件性CB₁R基因敲除小鼠:GAD2-CB₁R-KO/WT,VGLUT1-CB₁R-KO/WT和GFAP-CB₁R-KO/WT小鼠。EA预处理30 min,利用在体电生理技术,记录麻醉状态下小鼠dHPC CA3-CA1 fEPSP。【结果】特异性敲除GABA能神经元CB₁R,EA预处理无法诱导dHPC CA3-CA1在体LTD的产生（P<0.01）,但特异性敲除谷氨酸能神经元和星形胶质细胞CB₁R并不影响EA预处理诱导LTD的产生。【结论】EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD的产生需要GABA能神经元CB₁R而不是谷氨酸能神经元或星形胶质细胞CB₁R的参与。实验六EA预处理通过GABA能神经元CB₁R诱导dHPC CA3-CA1在体LTD介导脑缺血耐受【目的】研究EA预处理是否通过GABA能神经元CB₁R诱导dHPC CA3-CA1在体LTD在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。【方法】使用CB₁R-floxed小鼠与GAD2-iCreERT2转基因小鼠杂交,产生细胞特异性条件性CB₁R基因敲除小鼠:GAD2-CB₁R-KO,以及野生型同窝小鼠:GAD2-CB₁R-WT,EA预处理30 min,2 h后进行全脑缺血模型,全脑缺血20 min后恢复再灌注,72 h后多聚甲醛灌注取脑进行NeuN和FJB染色分别标记活性神经元和变性神经元,计数双侧dHPC CA1区NeuN和FJB阳性细胞数。【结果】NeuN和FJB染色和计数结果显示,GAD2-CB₁R-KO组与GAD2-CB₁R-WT组小鼠相比,电针预处理30 min后,NeuN阳性的活性神经元数量减少（P<0.01）,FJB阳性的变性神经元数量增多（P<0.01）,即全身性敲除GABA能神经元CB₁R阻断了EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD介导的神经保护作用。【结论】GABA能神经元CB₁R介导了EA预处理诱导dHPC CA3-CA1在体LTD的产生并对脑缺血损伤后dHPC CA1区神经元发挥缺血耐受效应。实验七EA预处理诱导dHPC CA1区GABA含量增多【目的】研究EA预处理对dHPC CA1区GABA水平的影响。【方法】雄性成年C57BL/6小鼠随机分为两组:EA组和假EA组,EA或假EA预处理30 min,利用在体微量透析技术,检测自由活动状态下小鼠dHPC CA1区细胞外液GABA的含量。【结果】结果显示,从EA预处理开始,dHPC CA1区细胞外液GABA的含量逐渐增加,到EA预处理30 min结束时达到最高值（P<0.01）,随后在EA预处理结束后的30 min内逐渐降低到基线水平,而假EA组dHPC CA1区GABA含量并没有明显的改变。【结论】EA预处理增加dHPC CA1区GABA的释放。实验八基因敲除GABA能神经元CB₁R阻断EA预处理诱导dHPC CA1区GABA含量的增多【目的】研究EA预处理是否通过GABA能神经元CB₁R介导dHPC CA1区GABA含量的改变。【方法】使用CB₁R-floxed小鼠与GAD2-iCreERT2转基因小鼠杂交,产生细胞特异性条件性CB₁R基因敲除小鼠:GAD2-CB₁R-KO,以及野生型同窝小鼠:GAD2-CB₁R-WT,EA预处理30 min,利用在体微量透析技术,检测自由活动状态下小鼠dHPC CA1区GABA的含量。【结果】结果显示EA预处理介导dHPC CA1区GABA含量增多的现象在GAD2-CB₁R-KO动物中消失（P<0.01）,而在GAD2-CB₁R-WT动物中并没有影响。【结论】EA预处理通过GABA能神经元CB₁R介导海马CA1区GABA含量增多。实验九EA预处理诱导的在体LTD不损害空间工作记忆【目的】探索EA预处理诱导的在体LTD是否损害空间工作记忆。【方法】将雄性成年SD大鼠随机分成以下三组:对照组,假EA组和EA组,利用T型迷宫检测大鼠的空间工作记忆。【结果】结果显示三组大鼠选择目标臂的正确率没有显著差异（P>0.05）。【结论】EA预处理诱导的在体LTD不损害大鼠的空间工作记忆。实验十全身性基因敲除GABA能神经元CB₁R不影响小鼠的自发运动和焦虑水平【目的】探索全身性GABA能神经元CB₁R基因敲除是否影响小鼠自发运动和焦虑水平。【方法】使用CB₁R-floxed小鼠与GAD2-iCreERT2转基因小鼠杂交,产生细胞特异性条件性CB₁R基因敲除小鼠:GAD2-CB₁R-KO,以及野生型同窝小鼠:GAD2-CB₁R-WT,利用旷场行为学和高架十字迷宫行为学检测方法,检测其自发运动能力和焦虑水平。【结果】1.GAD2-CB₁R-KO和GAD2-CB₁R-WT小鼠的旷场行为学检测结果显示,穿格次数、进入中心区域时间/总时间的百分比和进入中心区域的次数没有显著差异（P>0.05）;2.高架十字迷宫行为学检测结果显示,进入开臂时间/总时间的百分比,进入中心区域时间/总时间的百分比,以及进入开臂次数和进入中心区域次数均无显著差异（P>0.05）。【结论】全身性敲除GABA能神经元CB₁R不影响小鼠的自发运动性和焦虑水平。