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目的:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种常见而又严重危害人类健康的呼吸系统疾病，以气流受限呈进行性发展且不完全可逆为特征，是全球范围内发病率和死亡率增加的主要原因之一，造成了严重的经济和社会负担，这种情况日益加重[1]。目前临床上尚缺乏能够适时、准确评估AECOPD(acute exacerbation of COPD)的发生、发展及预后的指标，研究能够判断AECOPD发生、发展及预后的敏感指标具有重要意义。感染是COPD发生发展的重要因素。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以通过刺激机体各种免疫细胞产生大量的细胞炎症介质，引起机体的一系列炎症反应。P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是参与细胞内信号传导的重要激酶，介导炎症反应，在LPS导致的炎症瀑布反应中发挥重要作用[2]。p38MAPK抑制剂SB203580可抑制LPS所致肺部的炎症反应。本实验以健康人和AECOPD病人血清及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)为研究对象，观察健康对照组及不同程度AECOPD患者血清中TNF-a、IL-10、RANTES的水平及SB203580对LPS诱导的PBMCs分泌TNF-a、IL-10、RANTES水平的影响。探讨AECOPD病情严重程度与细胞因子TNF-a、IL-10、RANTES的相关性，为临床预防、治疗AECOPD提供新的思路。
方法:
1、研究对象:选择2012年3月-2013年1月我院呼吸内一科住院的AECOPD患者及同期门诊体检证实的健康志愿者。按2011年中华医学会呼吸分会制定的COPD及急性加重期的诊断标准分为:(1)AECOPD组;(2)健康对照组。根据FEV1/FVC、FEV1％预计值和临床表现将AECOPD组进一步分为Ⅱ级（中度组）(50％≤FEV1％＜80％)，Ⅲ级（重度组）(50％＜FEV1％≤30％)，Ⅳ级（极重度组）(FEV1％＜30％)。实验分组共4组:（D健康对照组;②AECOPD中度组;③AECOPD重度组;④AECOPD极重度组。
2、血清及PBMCs细胞上清TNF-a、IL-10、RANTES水平测定
2.1、标本采集:所有入选的对照组及实验组(AECOPD患者)于清晨空腹采肘静脉血8ml，其中3ml注入干燥的真空非抗凝管中，以4℃3000r/min离心15min，吸取上清液至于EP管，于-80℃冰箱内保存，待测TNF-a、IL-10、RANTES的水平。另5ml血注入EDTA抗凝管中，用于PBMCs的分离。
2.2、分离单个核细胞:用淋巴细胞分离液分离出每份血液中的单个核细胞。0.4％台盼蓝染色，排除无活性的细胞，活性细胞数＞95％可采用。用含10％小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度均为1×106/ml，备用。
2.3、ELISA法测定血清中TNF-a、IL-10、RANTES浓度。
2.4、ELISA法测定PBMCs细胞上清中TNF-a、IL-10、RANTES的含量变化。
3、实验分组:首先将分别将各组分离的PBMCs计数后用含10％小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度到1×106/ml，于24孔板中孵育(37℃CO2孵箱中)，实验共分5组。
3.1、对照组:加入与实验组等体积无血清RPMI1640培养液;
3.2、LPS组:终浓度1ug/mlLPS，刺激90min;
3.3、LPS+SB5组:加入终浓度5μMSB203580，1小时后加入终浓度1ug/mlLPS，刺激90min;
3.4、LPS+SB10组:加入终浓度10μMSB203580，1小时后加入终浓度1ug/mlLPS，刺激90min;
3.5、LPS+SB15组:加入终浓度15μMSB203580，1小时后加入终浓度1ug/mlLPS，刺激90min。
各实验组细胞刺激成功后，离心(1500r/min，4℃，10min)，收集细胞上清液。保存细胞上清液于-80℃冰箱内。ELISA法测定细胞上清中TNF-a、IL-10、RANTES的含量。
结果:
1、健康对照组及AECOPD患者血清细胞因子水平:(1)AECOPD患者三组之间血清TNF-a水平比较:重度组高于中度组(P＜0.05)，极重度组高于重度组(P＜0.05);AECOPD患者与健康对照组血清TNF-a水平比较:均明显高于对照组（P＜0.05）。(2)AECOPD三组之间血清RANTES水平比较:重度组、极重度组均高于中度组(P＜0.05);AECOPD患者中度组、重度组、极重度组血清RANTES水平均明显高于对照组(P＜0.05)。(3)AECOPD患者中度组、重度组、极重度组血清IL-10水平均明显低于对照组(P＜0.01);AECOPD患者三组之间血清IL-10水平无统计学差异(P＞0.05)。(4)AECOPD患者血清TNF-a、RANTES水平与FEV1％呈负相关(r=-0.957，P=0.00;r=-0.964，P=0.00);IL-10水平与FEV1％呈正相关(r=0.656，P=0.00)。
2、PBMCs上清细胞因子水平:(1)比较健康组及AECOPD中度组、重度组、极重度组PBMCs体外相同条件（加入等体积无血清RPMI1640）下分泌TNF-a、RANTES、IL-10的水平:细胞上清中IL-10含量比较:健康对照组高于AECOPD中度组(P＜0.05)，中度组高于重度组（P＜0.05），重度组高于极重度组(P＜0.05);细胞上清中TNF-a含量比较:中度组高于健康对照组(P＜0.05)，重度组高于中度组(P＜0.05)，极重度组高于重度组（P＜0.05）;细胞上清中RANTES含量比较:AECOPD极重度组细胞上清中RANTES含量高于健康组、中度组、重度组(P＜0.05)，健康组与AECOPD中度组、重度组比较比细胞上清中RANTES含量无明显差异(P＞0.05)，AECOPD中度组与重度组之间无显著差异(P＞0.05)。(2)体外不同刺激后比较PBMCs细胞上清中TNF-a、RANTES、IL-10含量:LPS刺激PBMCs后，健康组及AECOPD三组细胞上清液中TNF-a、RANTES含量较对照组增加（P＜0.05），而IL-10较对照组含量减低(P＜0.05);健康人细胞上清中TNF-a、RANTES、IL-10含量:IL-10含量随SB203580处理浓度增加而增加均高于LPS组(P＜0.05)，AECOPD三组中SB203580(5μM、10μM和15μM)预处理抑制LPS诱导的TNF-a、RANTES含量增加(P＜0.05)，但IL-10含量随SB203580预处理浓度增加而略增加，AECOPD三组之间比较无明显差异(P＞0.05)。
数据以均数±标准差((x)±s)表示。各组用单因素方差分析(OnewayANOVA)进行比较。如有显著性用Student-Newman-Keuls(SNK-q)检验，P＜0.05表示有统计学意义。
结论:
1、血清中TNF-a、RANTES与AECOPD病情严重程度正相关，与肺功能呈负相关;IL-10水平与AECOPD病情严重程度负相关，与肺功能正相关。可见TNF-a、RANTES在COPD发生、发展中参与了气道炎症反应，可能是COPD急性加重的重要指标，IL-10则发挥一定的抗炎作用。
2、对照组与实验组LPS刺激外周血单个核细胞引起细胞上清中TNF-a、RANTES分泌增加;用p38MAPK抑制剂SB203580干预后，TNF-a、RANTES分泌减少，提示SB203580可能抑制TNF-a、RANTES分泌。IL-10水平略有增加，说明抑制p38MAPK，可能会减轻炎症反应，减少抗炎因子的消耗。