论文部分内容阅读
目的:脓毒血症(sepsis)是由感染引起的一系列生理、病理、生化异常综合征。据报道脓毒血症发病率的增加与人口的老龄化、对脓毒血症疾病的认知增加、医疗报销有利等原因相关。尽管脓毒血症准确的发病率尚未清楚,但是在全球范围内保守估计脓毒血症是导致重大疾病和死亡的原因之一。此外,人们越来越意识到,脓毒血症患者即使存活下来,通常也会伴有身体、心理、和认知障碍,造成巨大健康保健负担和社会隐患。因此研究脓毒血症的发病机制对于改善脓毒血症的治疗方案有着重要意义。严重的脓毒血症患者病死率高达30%-50%,而呼吸衰竭是脓毒血症常见的死亡原因。引起呼吸衰竭主要有两方面因素,一方面是肺脏的损伤,另一方面是呼吸肌肉的损伤。以往的研究主要集中于由肺脏的损伤引起的呼吸衰竭,而忽略了呼吸肌肉的功能障碍引起的呼吸衰竭。膈肌是人体重要的呼吸肌,提供呼吸动力的60%-80%,因此在脓毒血症的发病机制中研究膈肌功能障碍非常关键。以往的研究报道脓毒血症导致膈肌功能障碍的原因有:线粒体功能障碍、膈肌的病理学改变、膈肌细胞的氧化损伤、细胞因子作用及氧化应激损伤。然而,骨骼肌的收缩依靠兴奋收缩耦联的发生,细胞内钙离子浓度的改变是诱发骨骼肌兴奋收缩耦联的关键。在骨骼肌中,细胞内钙离子浓度的改变依靠存在于细胞膜凹陷形成的T管上的L型钙通道(DHPR)与位于肌浆网膜上的兰尼碱(ryanodine)受体钙释放通道(RyR)的耦联。有研究报道在骨骼肌中,细胞内钙离子浓度的改变可直接影响骨骼肌的收缩力,而膈肌是骨骼肌的一种,所以细胞内钙离子浓度是膈肌收缩的关键。然而,在脓毒血症时膈肌细胞内钙离子浓度的变化并不清楚。L型钙通道(DHPR)和兰尼碱(ryanodine)受体钙释放通道(RyR)是横纹肌兴奋收缩耦联的重要组成部分。DHPR分为骨骼肌(DHPRα1s)和心肌(DHPRα1c)型。RyR分为骨骼肌(RyR1),心肌(RyR2)和脑与平滑肌(RyR3)同种型。有研究报道组成膈肌兴奋收缩耦联的DHPR和RyR的主要类型为DHPRα1s和RyR1。本实验首先制备大鼠脓毒血症动物模型,评价脓毒血症诱导的膈肌的收缩功能,观察膈肌组织的病理学改变,其次研究兴奋收缩耦联膈肌DHPRα1s和RyR1的分布和共定位情况,最后探索膈肌细胞的急性分离方法及膈肌细胞内钙离子的变化,膈肌细胞内钙离子浓度的改变与钙释放相关通道DHPRα1s和RyR1蛋白表达水平及膈肌功能之间的关系,旨在阐明脓毒血症诱导膈肌功能障碍的核心机制。 方法:⑴大鼠脓毒血症动物模型的制备评价。实验组动物腹腔注射LPS建立大鼠脓毒血症动物模型,并监测对照组和实验组大鼠的呼吸频率、平均动脉血压、肺组织病理学改变、肺组织水肿情况及实验动物的死亡率。⑵膈肌离体收缩力的测定。采用刺激仪(Grass S88; Astro-Med,West Warwick,Rhode Island,USA)0.5ms单脉冲方波刺激离体膈肌条,每次刺激间隔2分钟,测量脓毒血症组和对照组的大鼠膈肌峰抽搐压力(Pt/CSA)、不同刺激频率与收缩力的关系曲线、疲劳指数(FI/CSA)。⑶膈肌的形态学观察。采用光学显微镜和电子显微镜技术观察脓毒血症组和对照组的大鼠膈肌的大体形态学变化和超微结构的改变。⑷钙释放蛋白DHPRα1s和RyR1的蛋白表达水平和DHPRα1s与RyR1共定位。采用免疫组化和免疫荧光的方法检测钙释放蛋白DHPRα1s和RyR1的蛋白表达水平和DHPRα1s与RyR1共定位。⑸膈肌细胞的体外急性分离。采用胶原酶消化膈肌组织的方法对脓毒血症组和对照组的大鼠膈肌细胞进行体外急性分离。⑹膈肌细胞内钙离子浓度的测定。采用共聚焦和荧光分光光度计的方法检测脓毒血症组和对照组的大鼠膈肌细胞内钙离子浓度。 结果:①大鼠脓毒血症动物模型的制备评价:sepsis组平均动脉压较对照组相比明显下降(P<0.05);sepsis组呼吸频率较对照组相比无明显改变(P>0.05);sepsis组肺组织损伤评分明显较对照组增高(P<0.05),结果表明,脓毒血症会导致肺组织损伤;sepsis组肺组织的湿/干重比明显较对照组增高(P<0.05)。结果表明,脓毒血症会导致肺组织水肿;sepsis24h实验动物死亡率为43%。②膈肌离体收缩力的测定:在大鼠脓毒血症动物模型中,与对照组相比,脓毒血症组膈肌的峰抽搐压力Pt显著降低(P<0.05);在不同刺激频率(10Hz,20Hz,30Hz,40Hz,50Hz,75Hz,100Hz)均显著减弱(P<0.05);疲劳指数显著降低(P<0.05)。③膈肌的形态学观察:在大鼠脓毒血症动物模型中,与对照组相比,采用光镜观察膈肌的结构无明显改变,采用电子显微镜观察膈肌的超微结构发现膈肌的正常肌纤维NMF体积分数没有改变(P>0.05),膈肌的正常线粒体NSR的体积分数显著降低(P<0.05),脓毒血症组的膈肌纤维没有明显破坏,但肌浆网出现了明显改变。④膈肌的钙释放蛋白RyR1和DHPRα1s的蛋白表达水平:在大鼠脓毒血症动物模型中,与对照组相比,脓毒血症组膈肌的钙释放相关蛋白RyR1和DHPRα1s的OD值出现显著降低,即RyR1和DHPRα1s的表达降低。⑤膈肌的钙释放相关蛋白RyR1和DHPRα1s的分布及共定位关系:在大鼠脓毒血症动物模型中,RyR1弥漫分布在肌节中间,而DHPRα1s分布在肌膜。与对照组相比,在脓毒症组中,指示RyR1和DHPRα1s的共定位的Manders的重叠系数没有显著变化(P>0.05)。⑥膈肌细胞内钙离子浓度的测定:通过共聚焦显微镜测量细胞内钙离子平均荧光强度,结果显示在大鼠脓毒血症动物模型中,与对照组相比,脓毒血症组膈肌细胞内钙离子的平均荧光强度显著降低(P<0.05)。通过荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度,结果显示在大鼠脓毒血症动物模型中,与对照组相比,脓毒血症组膈肌细胞内钙离子浓度显著降低(P<0.05)。⑦膈肌细胞内钙离子浓度的改变与下降的膈肌收缩力的关系:大鼠脓毒血症动物模型中细胞内钙离子浓度的改变与下降的膈肌收缩力的呈直线相关关系(P<0.01)。⑧膈肌细胞内钙离子浓度的改变与降低的钙释放相关蛋白RyR1和DHPRα1s的表达之间的关系:大鼠脓毒血症动物模型中细胞内钙离子浓度的改变与降低的钙释放相关蛋白RyR1和DHPRα1s的表达呈直线相关关系(P<0.01)。 结论:⑴大鼠脓毒血症动物模型中膈肌的离体收缩力下降。⑵大鼠脓毒血症动物模型中膈肌肌节无明显改变,肌浆网出现肿胀。⑶大鼠脓毒血症动物模型中DHPRα1s和RyR的蛋白表达下降。⑷大鼠脓毒血症动物模型中DHPRα1s和RyR1蛋白的分布和共定位无明显改变。⑸大鼠脓毒血症动物模型中膈肌细胞内钙离子浓度降低。⑹大鼠脓毒血症动物模型中,减少的膈肌细胞内钙离子浓度与DHPRα1s和RyR1蛋白表达的降低及膈肌功能障碍有相关性。