众所周知,当人的年龄超过 40 岁后,随着年龄的增加,学习记忆力普遍下降,这给人们的学习、工作和生活带来无限的烦恼和痛苦。因而研究这种中老年增龄性学习记忆力减退的原因及提出防治措施,对于日益走向老龄化的当今社会有重要的现实意义。 学习记忆力的衰老性下降与神经元的损伤或失去保护作用有密切的关系。研究认为,雌激素具有抗氧化和神经营养作用,可减轻神经细胞的损伤或对神经细胞提供保护。临床观察指出,中老年女性在卵巢萎缩、性功能减退、内分泌紊乱甚至绝经的同时往往伴有明显的记忆力减退,而补肾类中药大多在明显增强生殖功能的作用的同时具有显著的促智作用。补肾中药益智的确切作用机理并未完全研究清楚,有些补肾中药具有雌激素样作用,有些则具有促进雌激素生成的作用,众多研究主要围绕下丘脑-垂体-性腺轴展开,并取得了可喜的成果。芳香化酶是雌激素的合成限速酶,除在性腺大量存在外,在脂肪、乳腺等组织中也有分布,最近研究发现,在与学习记忆相关的脑区也有广泛分布。芳香化酶在衰老性记忆力减退过程中扮演什么角色、是否参与补肾作用或促智过程,值得深入开展研究。 1 目的 本研究根据上述假设,运用芳香化酶抑制剂使动物脑内处于低雌激素状态,然后运用行为学方法、电生理技术和形态学手段,考察动物的学习记忆能力及相关指标,为建立一种学习记忆障碍模型动物奠定基础。 根据中医补肾益智的学说,对具有明显的促智作用的中医复方进行筛选,从行为学、神经病理学、细胞、内分泌等多方面,着力观察补肾复方对雌激素及其合成酶——芳香化酶的影响,以便阐明该类复方改善中老年增龄性记忆减退的作用及其作用机理。 2 材料与方法2.1 低雌激素动物模型的建立 3 月龄雌性 SD 大鼠,随机分为假手术组(sham)、去卵巢组(OVX)和去卵巢加用依西美坦(OVX+EXE)组,每组 20 只,除假手术组外,各大鼠均摘除双侧卵巢,依西美坦组大鼠按 60mg·kg-1皮下注射,假手术组和去卵巢组皮下注射同容积的溶剂,每三日一次,共给药30d。然后运用跳台法、避暗法和 Morris 水迷宫法观察对动物学习记忆能力的影响。行为学实验结束次日,取一半动物作脑切片,4%多聚甲醛灌注取材,常规石蜡切片,沿海马横轴垂直方向连续冠状切片。按 SP 法作芳香化酶免疫组织化学染色,观察芳香化酶的表达及大致分布。 另一半动物分别用同位素法测血浆和脑内雌激素的含量。用预冷的含有 5%乙醇的生理盐水与脑组织充分匀浆后,离心,取上清。再用碱性二氯甲烷萃取,吹干。次日,以 0.1mL95%乙醇溶解,最终定容至 0.5mL,并按试剂盒要求进行测定。血清雌激素含量测定,在上述大鼠断头时取动脉血,4℃冰箱放置过夜,次日,离心,取 200μL 血清,按试剂盒要求进行测定。按试剂盒方法测大脑皮层 AchE、NE 和 DA。<WP=6>iv 脑雌激素低下对学习记忆的影响及益智方的作用与作用机制研究2.2 益智方的筛选 运用混料均匀设计法对益智方进行拆方分析,考察方中各类药对上述模型小鼠学习记忆行为的影响。益智方由安神(X1)、补肾(X2)、健脾(X3)三类中药组成,以这三类中药作为考察因素,选择均匀设计表 U5(52),配制 5 种不同的复方,每个水平不重复出现。取80 只雌性小鼠,70 只摘除卵巢,10 只作假手术。10d 后对去卵巢存活小鼠进行阴道涂片,取阴道角化细胞阴性持续 7d 者供实验用,饲养 20 周后,取其中 40 只,随机分为 5 组,每组 8只作为 5 个复方给药组,按 15g 生药·kg-1剂量灌胃给药;另取其中 20 只分为 2 组,每组 10只,分别为模型组和雌二醇组,假手术 10 只作对照组,前者按 0.2mg·kg-1给小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇,4 日一次,后者以 5%吐温-80 替代药物灌胃,每日一次,各组均连续给药 32d。通过去卵巢小鼠在 Morris 水迷宫中的行为学变化,测试小鼠用药后的学习记忆能力,并筛选出最佳配比和配方。2.3 益智方对模型大鼠的保护作用及机制 大鼠造模的同时灌胃梯度剂量(ig,7.5、15g 生药·kg-1·d-1)的益智方药,阳性对照组为苯甲酸雌二醇(sc,0.2mg·kg-1·4d-1),假手术组和模型组给 5%吐温。给药 35d 后,观察记录各组大鼠在跳台实验、避暗实验和 Morris 水迷宫实验中的行为变化。行为学实验结束次日,仿前述方法,进行血浆和脑内雌激素、AchE、NE 和 DA 的含量的测定。 将麻醉大鼠固定于立体定位仪上,双极刺激电极的位置为内嗅区前穿质通路,其定位坐标为 AP-6.8mm,L4.2mm,H3.5mm,记录电极坐标为 AP-3.5mm,L2.0mm,H3.0mm,位于同侧海马齿状回颗粒细胞层,以固定强度的刺激诱发出最大群峰电位(PS)。记录间隔为每30s 记录一次,测试刺激频率 1/30Hz、波宽 0.1ms、时间常数为 0.001s,高通滤波为 10KHz。记录 PS 幅值,作为 DG 颗粒细胞群兴奋性的指标。高频刺激(high frequent stimulate,HFS)由 10 串 100Hz、每串 5 个波宽 0.1ms 的方波刺激组成,刺激间隔为 200ms,刺激强度与单个测试刺激相同。观察 PS 幅度、峰潜伏期,LTP 诱发成功率、高频刺激的效应,从电生理学角度研究麻醉模型大鼠的突触传递活动,以及益智方对大鼠突触传递活动的?