目的：组织工程的常用方法是，将种子细胞种植于一种生物相容性良好并可被人体逐渐降解吸收的生物材料上进行扩增，形成细胞/生物材料结构物后回植体内修复受损组织。此时生物材料支架为细胞提供生存所需的三维空间，对细胞的有序构筑起接触、引导及支架作用，使细胞能在预先设计的三维形状支架上生长。骨髓基质细胞(MSCs)在体内及体外具有向神经细胞分化的潜能，其具有来源广泛、易于培养和自体移植不引起排斥反应、不涉及伦理问题等优点，是构建组织工程的理想种子细胞来源。为寻找理想的组织相容物，本实验观察MSCs在壳聚糖/β-磷酸甘油钠(C/GP)凝胶中的存活和生长，有望为微创方式修复脑损伤摸索一种新的可注射性组织工程MSCs，为应用自体干细胞移植寻找较合适的可注射性载体提供实验依据。 方法：1.取SD大鼠(体重50-60g)，麻醉处死后无菌条件下取双侧股、胫骨的骨髓，用贴壁培养法分离出MSCs，进行培养，并传代扩增以纯化MSCs，并连续观察细胞形态及生长特性。 2. 室温状态下用吸管将β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴入壳聚糖溶液中，边滴加边混匀，按照(9-1)：1梯度体积比配置成C/GP复合溶液，分别测混合液的PH值及37℃条件下的凝固时间(以凝胶在容器内倒置90°不流动、不变形为凝胶形成的标准)，选择最适混合比。 3. 取传3代的MSCs，以5.0×10<4>/ml密度，接种于C/GP(体积比3∶2)混合溶液中，加入96孔培养板中培养，每孑乙加0.09ml的细胞-C/GP复合物，置37℃孵箱10 min形成凝胶后，每孔加入完全培养液0.1ml，每日换液。隔日在倒置显微镜下观察MSCs三维培养。 4. 制备单细胞悬液加完全培养基，接种于96孔培养板，每孔20μl细胞悬液加C/GP复合物10μl，设为实验组；每孔取20μl细胞悬液加10μl完全培养基，设为细胞对照组；每孔取10μl C/GP复合物加完全培养基20μl，设为C/GP对照组。从第2天起，24h后每组取3孔细胞用酶标仪测OD值，连续7d，绘制生长曲线分别。对两组的OD值作t检验，进行统计学分析 结果：1.分离出的MSCs呈圆形，约72h后绝大多数细胞已贴壁，细胞形态为梭形，多角形，约7～10天可达80％融合，此时细胞呈长梭形，传代细胞较原代细胞成长快，约3～7天基本铺满瓶底。 2. 在室温时，C/GP溶液呈半透明状态，具有流动性：在升温至37℃后，C/GP溶液变成白色不透明固体状，失去了流动性。温度的上升造成系统的溶胶/凝胶转变。而随着壳聚糖与β-甘油磷酸钠的体积比的变化，C/GP溶液的PH值及37℃凝固时间亦不同(见附表2)。 3. 接种于C/GP复合物24h后见细胞成球状，未见明显梭形及多角形细胞，48h内生长速度较慢，72h后可见梭形，多角形细胞，细胞数量明显增多。 4. 通过绘制MSCs生长曲线，可得出两条“S”形曲线，实验组的细胞潜伏适应期为第1个24h，第2～3个24h为对数生长期，5天后细胞增殖减慢，6天后细胞基本停止生长。而细胞对照组的细胞潜伏适应期为第1～2个24h，对数生长期推后至3～5个24h，1周后细胞基本停止生长。经过统计学分析，认为实验组和对照组的OD值无差异，MSCs在C/GP凝胶(体积比3∶2)中可良好存活、增殖。 结论：1. MSCs在体外培养条件下具有很强的增殖能力，生长特性稳定。 2. 壳聚糖/β-甘油磷酸钠混合物在室温状态下为液态，调整不同体积比37℃凝固时间可有差别，为温敏型壳聚糖水凝胶。 3. MSCs在C/GP凝胶(体积比3∶2)中可良好存活、增殖，C/GP凝胶(体积比3∶2)ph为7.2，符合体内酸碱度，37℃凝固时间为10分，较好地满足可注射支架材料的要求，温敏型壳聚糖水凝胶可作为组织工程中良好的可注射型载体。