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目的:本课题通过观察小青龙汤治疗变应性鼻炎的临床观察、网络药理学挖掘小青龙汤的活性成分和潜在靶点、以及小青龙汤的活性成分儿茶素治疗变应性鼻炎小鼠的动物实验,来探讨小青龙汤治疗变应性鼻炎的作用机制,尤其是其发挥作用的有效成分、免疫调控机制以及可能的作用靶点。方法:1.临床观察部分:收集肺气虚寒型持续性中重度变应性鼻炎患者65例,随机分为小青龙汤组(治疗组)33例、氯雷他定组(观察组)32例,治疗组以小青龙汤为主方随患者症状予以相应加减,日一剂,连续服用2周;观察组以氯雷他定片口服,1Omg/次,每日一次,连续用药2周。记录患者症状、体征变化,采用鼻部症状单项评分法(Individual nasal symptom score,INSS)和鼻部症状综合评分法(Total nasal symptom score,TNSS)记录患者主观鼻敏感症状评分以测定病情程度;通过鼻结膜炎相关生活质量调查问卷(Rhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire,RQLQ)调查患者治疗前后生活质量的变化,评估小青龙汤治疗持续性中重度变应性鼻炎肺气虚寒型的临床疗效以及对患者生活质量的影响。2.网络药理学研究:通过TCMSP数据库分别检索小青龙汤中麻黄、桂枝、干姜、细辛、五味子、白芍、半夏、炙甘草的生物活性成分及其对应靶标,通过NCBI Gene数据库查询变应性鼻炎相关基因。挖掘小青龙汤治疗变应性鼻炎的有效活性成分,并整合小青龙汤靶基因和疾病靶基因,通过软件构建药物和疾病靶点的蛋白相互作用网络,发掘其作用靶点及生物富集信息,探讨小青龙汤治疗变应性鼻炎的活性成分和可能靶点。3.动物实验部分:采用6～8周龄SPF级雌性BALB/C小鼠,体质量为18～22g,按照完全随机设计分为空白对照组、模型组、儿茶素低、中、高剂量组和阳性药物组。除对照组外,采用腹腔注射OVA基础致敏,及OVA滴鼻激发构建AR小鼠模型,成功造模后,模型组和对照组予以磷酸盐缓冲液灌胃,阳性药物组以氯雷他定混悬液灌胃,儿茶素低、中、高剂量组以相应剂量的儿茶素灌胃。观察小鼠连续挠鼻、打喷嚏等行为学改变;取外周血检测其炎症细胞含量变化;取胸腺、脾脏检测其免疫器官脏器指数变化;取鼻腔黏膜行组织切片,HE染色观察鼻黏膜炎症状态;采用ELISA 法检测血清中 OVA-sIgE、IFN-γ、IL-5、IL-13 的含量;采用 Western Blot检测鼻黏膜组织中TSLP、OX40L、JAK2、P-JAK2、STAT5、P-STAT5蛋白表达。明确小青龙汤治疗变应性鼻炎的物质基础、可能的免疫调控靶点,探讨小青龙汤治疗变应性鼻炎的具体药理机制。结果:1.临床疗效观察:本研究纳入持续性中重度变应性鼻炎中属肺气虚寒证型患者,共65例,随机分为小青龙汤组(治疗组)和氯雷他定组(观察组),记录治疗前和治疗2周后患者症状评分及RQLQ评分。其中,治疗组鼻部症状综合评分由9.55±1.23下降至4.58±1.28,观察组鼻部症状综合评分由9.31±1.03下降至4.72±0.96,治疗2周后观察组鼻部症状综合评分较治疗组偏高,但是其差异无统计学意义(P>0.05)。鼻部症状单项评分中:治疗组鼻痒评分由2.36±0.49下降至1.12±0.70,打喷嚏评分由2.36±0.65下降至1.09±0.72,流清涕评分由2.33±0.60下降至1.18±0.64,鼻塞由2.48±0.62下降至1.18±0.73;观察组鼻痒评分由2.16±0.45下降至1.00±0.51,打喷嚏评分由2.38±0.55下降至1.31 ±0.54,流清涕评分由2.28±0.58下降至0.97±0.65,鼻塞评分由2.50±0.62下降至1.44±0.62。比较两组治疗后的鼻部症状单项评分,鼻痒、打喷嚏、流清涕和鼻塞等症状表现无临床差异(P>0.05)。而治疗组RQLQ评分由71.88±24.21下降至41.03±14.27,观察组RQLQ评分由72.16±22.54下降至41.16±14.63,评估两组间RQLQ评分无显著性差异(P>0.05)。2.网络药理学分析结果:通过查询TCMSP数据库,筛选出小青龙汤中156个活性成分,收集到人源靶蛋白299个(麻黄228个、桂枝40个、干姜44个、细辛106个、五味子4个、白芍90个、半夏97个、甘草229个);通过查询NCBI Gene数据库搜集到变应性鼻炎相关人源基因411个,并整合小青龙汤靶基因和疾病靶基因,通过软件构建药物和疾病靶点的蛋白相互作用网络,发掘其作用靶点及生物富集信息,筛选出48个核心靶点,对核心靶点进行GO生物功能分析,发现小青龙汤可通过调节白介素相关信号、糖代谢、炎症反应、流体剪切应力、细胞因子合成、免疫调节、Th17细胞分化、物质合成与代谢、氧化应激反应、细胞活化的调节、MAPK级联调节、参与免疫反应的白细胞活化、趋化因子的产生等生物学过程调控变应性鼻炎。3.动物实验:(1)儿茶素缓解AR小鼠鼻部敏感症状:通过OVA腹腔注射及滴鼻激发致敏后,AR小鼠挠鼻、打喷嚏次数明显增多,予以儿茶素干预后,可减少其打喷嚏、挠鼻的次数(P<0.05),缓解AR小鼠的鼻敏感症状。(2)儿茶素降低AR小鼠外周血炎症细胞的水平:AR小鼠外周血中的白细胞、单核细胞、粒细胞和淋巴细胞的水平较正常组明显升高(P<0.05),而高剂量儿茶素可降低白细胞、单核细胞、粒细胞和淋巴细胞在外周血中的水平,缓解炎症。(3)儿茶素可改善AR小鼠免疫功能:AR小鼠的脾脏、胸腺指数较空白对照组小鼠下降(P<0.05),儿茶素可提高AR小鼠脾脏指数(P<0.05);改善胸腺指数,但无统计学意义(P>0.05)。(4)儿茶素可缓解AR小鼠局部鼻黏膜炎症:HE染色结果显示模型组大量炎症细胞浸润,且黏膜的完整性遭到破坏,纤毛断裂,局部组织水肿。予以儿茶素干预后,其炎症细胞浸润较模型组明显减少,黏膜得以修复,纤毛密度稍改善,但是难以恢复到正常对照组的鼻腔黏膜状态。(5)儿茶素对血清OVA-sIgE、IFN-γ、IL-5、IL-13的含量的影响:通过ELISA检测血清OVA-sIgE和Th1/Th2细胞因子,发现AR模型组小鼠血清中OVA-sIgE、IL-5、IL-13显著升高(P<0.05),IFN-y含量明显降低(P<0.05),予以儿茶素干预,发现高剂量儿茶素可降低血清OVA-sIgE水平(P<0.05);各剂量儿茶素可升高IFN-γ、降低IL-13血清含量(P<0.05);中剂量儿茶素可降低血清IL-5含量(P<0.05)。(6)儿茶素抑制鼻黏膜组织中TSLP-OX40L通路:采用蛋白印迹法检测鼻黏膜组织中TSLP-OX40L通路中TSLP、OX40L蛋白的表达。结果显示,AR模型组鼻黏膜组织中TSLP-OX40L通路处于激活状态,TSLP、OX40L蛋白表达量增加,予以儿茶素干预后可改变其活化状态,且具有一定的剂量依赖性。(7)儿茶素抑制鼻黏膜组织中JAK2、P-JAK2、STAT5、P-STAT5蛋白的表达:通过蛋白印迹法检测鼻黏膜组织中JAK2/STAT5通路中的JAK2、STAT5及其磷酸化蛋白表达情况。结果表明AR模型组鼻黏膜组织中JAK2、STAT5蛋白表达量均较空白对照组明显增高,儿茶素不仅可以抑制二者总蛋白的表达,而且可以抑制其磷酸化。结论:1.小青龙汤对持续性中重度变应性鼻炎中属肺气虚寒证者,具有良好的临床疗效和安全性。2.通过网络药理学方法探索了小青龙汤治疗变应性鼻炎的作用机制及物质基础,发现小青龙汤可调节多种生物学过程发挥作用。其中富集程度最高的是白介素相关信号通路,我们关注到白介素相关信号通路;网络药理研究发现小青龙汤的君药麻黄和桂枝均富含儿茶素这一化合物,结合课题组前期经高效液相-质谱联用仪(HPLC-MS)检测小青龙汤入血成分中也含有儿茶素,且可通过抑制NF-κ B/TSLP通路减少炎症因子释放;但其通过TSLP抑制炎症因子释放的具体调控机制不明,为后续动物实验研究提供思路。3.儿茶素可能通过抑制JAK2/STAT5磷酸化,阻断TSLP-OX40L信号通路,降低Th2型细胞因子的水平,恢复AR的免疫平衡,发挥治疗AR的作用。4.小青龙汤治疗AR的物质基础中,儿茶素可能发挥一定的作用。