尼曼匹克C1型L1(Niemann-Pick C1 like 1,NPC1L1)蛋白是一个由1322个氨基酸组成的跨膜蛋白,其主要分布在哺乳动物的肠上皮细胞的顶端以介导肠内胆固醇的吸收,是哺乳动物维持机体胆固醇代谢平衡的重要蛋白之一。研究发现,人体的NPC1L1蛋白由NPC1L1基因编码,它除了在肠道表达以外,也表达在肝脏中,但其并不在小鼠肝脏中表达。文献报道肝脏NPC1L1蛋白与胆汁胆固醇重吸收密切相关。在此基础上,为了进一步在动物活体上研究肝脏NPC1L1的功能,本研究将人的NPC1L1蛋白表达在高胆固醇血症和酒精肝两种疾病模型小鼠的肝脏中,不仅研究肝脏NPC1L1蛋白的基本功能,还探究其与这两种疾病的潜在联系。另外,本研究还对NPC1L1蛋白与肝细胞自噬活动的关系进行了探究。主要分为以下几个部分:一、为了研究是否血清胆固醇浓度升高(高胆固醇血症)会影响肝脏NPC1L1蛋白的功能。本研究将NPC1L1蛋白表达在低密度脂蛋白受体缺失小鼠(LDLR-/-)的肝脏,来研究高胆固醇血症下此蛋白的功能。与野生型小鼠相比,LDLR-/-小鼠在饲喂高胆固醇日粮后血液胆固醇升高更显著,可模拟人高胆固醇血症时的血液胆固醇指标,而且它的血清脂蛋白分布比例更接近人类,是公认的研究高胆固醇血症的模型动物之一。故此本研究建立了LDLR-/-背景下的人肝脏NPC1L1转基因小鼠模型(L1-Tg/LDLR-/-)。研究表明L1-Tg/LDLR-/-小鼠在饲喂含高胆固醇的AD日粮(含0.2%胆固醇)或者普通日粮(Chow)后,血清胆固醇比对照组小鼠均有明显升高(P<0.05),而胆汁胆固醇的水平均显著降低(P<0.05)。说明肝脏NPC1L1蛋白维持了其重吸收胆汁胆固醇的功能。本研究还发现L1-Tg/LDLR-/-小鼠经粪便排泄的胆固醇量并不随着胆汁胆固醇排泄水平的降低而减少。这一发现从侧面证实了肠道胆固醇外流通路(Transintestinal cholesterol efflux,TICE)的存在。另外,除了胆固醇代谢方面,本研究还发现L1-Tg/LDLR-/-小鼠血清甘油三酯水平比对照组小鼠也有明显升高(P<0.05)。此结果经进一步研究证实,这是由于NPC1L1在肝脏中的表达促进了小鼠肝脏低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)的分泌。其中,最直接的证据就是与VLDL形成相关的甘油三酯水解酶(Triacylglycerol Hydrolase,TGH)的蛋白表达水平(P<0.01)和微粒体甘油三酯转移蛋白(Microsomal Triglyceride Transfer Protein,MTP)的蛋白表达水平(P<0.05)均显著升高。因此,NPC1L1蛋白在小鼠肝脏的表达造成VLDL分泌的增加最终导致血清甘油三酯的水平显著升高。这一发现提示了在临床上不仅要监控高胆固醇血症病人的血清胆固醇水平,也需要密切关注他们的血清甘油三酯水平。二、细胞自噬活动是在哺乳动物多种细胞中广泛发生的一种生物学现象。为了研究NPC1L1蛋白表达对肝细胞自噬活动的影响,本文通过分离培养小鼠的肝脏原代细胞,用荧光显微技术在细胞水平上观察肝细胞自噬活动,同时结合蛋白表达的相关证据,研究了肝脏NPC1L1蛋白对肝细胞自噬的影响。研究结果表明当肝脏表达NPC1L1蛋白时,无论在营养缺失或自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)处理下,自噬标志物的形成都会减少(P<0.05)。同时,蛋白免疫印迹法检测自噬相关标志蛋白的表达水平所得结论于此一致,二者证实了NPC1L1蛋白表达对肝脏原代细胞自噬活动有抑制作用。而且当NPC1L1蛋白的抑制剂依泽替米贝(Ezetimibe)存在时,肝细胞自噬可明显被激活(P<0.05)。此外,本研究还发现如果抑制肝细胞的甘油三酯脂酶(ATGL),会导致肝细胞中脂滴聚集,而此时以脂滴为目标物的脂类自噬(Lipophagy)水平下降。三、酒精肝是人常见的重要肝脏疾病之一,其发病机理与肝细胞脂代谢通路以及肝细胞氧化应激密切相关。为了研究肝脏NPC1L1蛋白的表达在酒精性肝损伤初期病变过程中作用,本研究分别给肝脏表达NPC1L1蛋白的小鼠和其对照组小鼠短期饲喂酒精。同时,为了配合短期酒精饲喂的研究进程,本研究采用腺病毒转录系统将NPC1L1表达至C57BL/6小鼠肝脏(Ad-L1)。研究结果发现肝脏NPC1L1的表达并不能显著影响小鼠的生理指标。而且经过比较了肝脏病理切片后,本研究发现肝脏NPC1L1蛋白的表达并不显著改变肝脏对酒精刺激的炎症反应或肝组织纤维化的进程。同样的,NPC1L1蛋白表达也不能明显影响小鼠体内酒精的代谢速率,Ad-L1小鼠摄入酒精后也出现了脂滴聚集,伴随着血清转氨酶水平上升(P<0.05)、某些炎症因子表达升高等肝损伤的病理现象,这些与对照组小鼠并无明显差异。说明NPC1L1在肝脏的表达并不能显著性影响酒精性脂肪肝的发生。四、在酒精肝病变的不同阶段,肝细胞自噬活动水平并不相同,文献显示急性酒精摄入后会激活肝细胞自噬以有利于酒精解毒,而长期酒精摄入后,因肝细胞受损且逐渐丧失细胞的基本功能,导致肝细胞自噬活动水平降低。为了研究肝脏NPC1L1蛋白的表达与酒精摄入情况下肝细胞自噬的关系,本研究在急性酒精摄入和慢性酒精饲喂小鼠的情况下,通过分离培养原代肝细胞,并用荧光显微技术观察肝细胞自噬活动,并结合蛋白水平与转录水平的研究,来评估NPC1L蛋白对酒精刺激下肝细胞自噬的影响。研究结果发现在小鼠短期酒精摄入后,肝脏NPC1L1表达的Ad-L1小鼠肝细胞自噬标志蛋白LC3与溶酶体的融合明显减少(P<0.05)。蛋白免疫印记法显示LC3II的表达比例升高(P<0.05),P62蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)。以上结果均证实了肝细胞自噬通路被抑制。而在NPC1L1抑制剂Ezetimibe存在时,肝细胞自噬可明显被激活。同样地,在慢性酒精摄入的研究中,肝脏NPC1L1表达小鼠整体上也有抑制肝细胞自噬活动的趋势。综上所述,肝脏NPC1L1蛋白的表达维持了高胆固醇血状态下机体胆固醇代谢的肝肠循环,也促进了肝脏VLDL的分泌,导致血清甘油三酯水平上升。此结论提示了在临床上监控高胆固醇血症病人血清甘油三酯的重要性。另外,本研究还侧面证实了肠内胆固醇转运通路的存在,丰富了人们对哺乳动物胆固醇代谢通路的理解。无论是否摄入酒精,肝脏NPC1L1蛋白的表达都在一定程度上抑制了肝细胞自噬的发生。但是,这并不显著改善酒精对肝组织的损伤。说明人酒精性脂肪肝的发生与肝细胞的自噬水平高低可能没有直接的关系。