类芽孢杆菌是一类可以产生芽孢的微生物,因其抗逆性强,且能够产生促进植物生长和抗菌类的物质,在农业生产中具有广泛的应用价值。多粘类芽抱杆菌菌株Paenibacillus polymyxa WLY78是具有固氮功能的类芽孢杆菌,这一类微生物通常在无铵或低铵(0-2 mM)条件下固氮,铵浓度高的条件下只生长但不固氮。目前,铵对生物固氮的影响在革兰氏阴性固氮菌中研究的比较深入,而由于革兰氏阳性细菌遗传转化操作难度较大,致使固氮类芽孢杆菌的固氮调控机制尚不清楚。阐明多粘类芽孢杆菌的固氮调控机制,不仅能揭示革兰氏阴性和革兰氏阳性固氮菌在固氮调控机制方面的异同,同时对突破铵对固氮过程的抑制、构建抗铵菌株并使其在农业生产中充分发挥固氮作用也具有重要的理论和实践意义。GlnR是枯草芽孢杆菌中的氮代谢总调控因子。在氮充足条件下,GlnR抑制glnRA(glnA编码谷氨酰胺合成酶)、tnrA(编码枯草芽孢杆菌中的另一种氮代谢总调控因子)及ureABC(脲酶)的转录。比较基因组学研究发现,Paenibacillus polymyxa WLY78中有一个glnR基因,glnR基因与glnA基因构成一个转录单元,同时基因组中还有一个glnA基因(称为glnA1基因)。本工作通过构建基因缺失突变株,确认了 GlnR是多粘类芽孢杆菌固氮条件下正常进行固氮所必须的调控因子,而与glnR共M转录的glnA基因编码的谷氨醜胺合成酶GS协助GlnR参与了高铵条件下对固氮基因簇转录的负调控。EMSA、SPR以及ChIP-qPCR实验结果表明,固氮基因簇启动子中存在两个GlnR结合位点,其中位于转录起始位点下游的结合位点II与GlnR的亲和力高于位于-35区上游的结合位点I。GlnR独自即可与两个结合位点结合,而抑制型的谷氨酰胺合成酶FBI-GS能够显著增强这一结合,对GlnR与结合位点Ⅱ间的结合增强作用尤为显著。对GlnR结合位点的突变与缺失实验显示结合位点Ⅰ是激活固氮基因簇转录所必须的,而结合位点Ⅱ与固氮基因簇表达的负调控相关。以上结果首次揭示了 GlnR通过与不同位点结合来响应铵离子浓度变化对固氮基因簇转录进行正负调控。本工作不仅提出了类芽孢杆菌中固氮基因表达的新型调控机制,还揭示了 GlnR正调控与负调控两方面的调控功能。本工作通过在全基因组范围内预测GlnR结合位点,并利用ChIP-qPCR与EMSA技术进行验证,发现了glnA1,appABCDF,ldh等基因的转录直接受GlnR调控。通过在无铵和高铵两种条件下对野生型和glnR基因缺失突变株的转录组进行比对分析,发现了 GlnR在无铵和高铵两种条件下都能够发挥调控功能,且其调控功能同时包含正调控与负调控。通过对氮代谢和碳代谢相关基因的比对分析以及利用不同氮源和碳源的生长实验,揭示了 GlnR在碳氮代谢的联系中发挥的重要作用。通过对固氮基因簇以外的固氮酶合成相关基因的比较分析,揭示了 GlnR在调控固氮基因簇转录水平的同时还影响着固氮酶合成必须元素的运输与代谢过程。本工作在普遍已知的GlnR主要在氮源充足条件下抑制氮同化相关基因表达的基础上,拓展了对GlnR功能的认知。本工作揭示了多粘类芽孢杆菌中固氮基因转录的调控机制,并发现了 GlnR作为全局调控因子的多种调控模式与功能。本工作有助于对固氮类芽孢杆菌中复杂的氮代谢调控网络的了解,并为适合更广泛环境条件的固氮工程菌株的构建提供了理论依据。