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多粘菌素是从多粘杆菌的培养液中分离得到的多肽类抗生素,对多数革兰氏阴性需氧菌有杀灭作用,但因其显著的肾毒性和神经毒性,在过去很少用于临床。但是,随着近些年来超级细菌等多重耐药菌的不断涌现,大多数抗菌药物束手无策,而多粘菌素的药敏试验结果是“敏感”,故又重回医务、科研人员的视野。然而,2015年11月,在柳叶刀上华南农业大学的刘健华等首次报道了在中国的动物和人类中出现了由质粒介导的、能够水平传播的抗黏菌素的耐药基因mcr-1(mobile colistin resistance)。此后,陆续有美国、法国、英国等发现并报道了mcr-1基因,并且分离得到的mcr-1基因不仅仅出现在猪、鸡等动物身上,从食品、水、蔬菜等中也分离出了mcr-1基因。由于其突破了抗生素最后一道防线,mcr-1耐药基因的全球传播逐渐引起人们的密切关注。电化学DNA生物传感技术是以单链DNA或双链DNA为敏感元件,将核酸分子相互作用产生的生物学信号转变成可以检测的电信号,从而实现对DNA的定性或定量检测。基于黏菌素耐药基因mcr-1的广泛传播,以及临床治疗形势的严峻性,我们初步探讨利用电化学DNA传感技术检测mcr-1,为质粒介导黏菌素耐药基因的便携式快速检测打下理论及初步实践基础,也为临床其它常见耐药基因的检测提供通用技术平台。首先,设计5’端修饰有巯基(HS-)的ssDNA,通过金硫键将其固定在金电极表面,用巯基己醇封闭空白位点,以减免非特异性吸附。HS-ssDNA在金电极表面自组装成稳定的单分子层后,在适宜的条件(如温度、pH、离子强度等)下,特异性识别质粒DNA的酶切产物,通过电化学工作站检测电信号的变化,从而成功检测到mcr-1耐药基因片段;并且通过对其特异性、线性范围、检测限等指标进行评价,证明了采用电化学生物传感器技术检测质粒介导的大肠埃希菌耐黏菌素mcr-1耐药基因的可行性。其次,为了解决普通金电极操作复杂、耗时耗力且检测灵敏度不足等问题,我们构建了基于teohold介导杂交链式反应(HCR)和丝网印刷金电极的无酶无标记液相生物传感检测技术平台。设计含有粘性末端的茎环状DNA探针(toehold probe),当靶基因mcr-1基因片段存在于溶液中时,通过toehold介导的杂交链式反应使茎环状DNA探针的茎部打开,暴露出杂交链式反应(HCR)的引发链,引发链启动toehold介导的HCR反应,最终形成超长的双链结构。结合可插入dsDNA双螺旋结构内的电化学指示剂亚甲基蓝(MB),构建无酶无标记的DNA自组装放大系统。与游离MB相比,MB/dsDNA复合物中MB的扩散速率明显降低,所以MB与dsDNA的结合能大幅度降低MB在均相溶液中的反应电流,在丝网印刷金电极上检测电流减弱的变化和程度。实验结果证明,在10nM到1μtM的范围内,构建的检测体系的△ip与mcr-1 gene的浓度呈线性正相关的关系,且通过对检测体系的碱基错配能力的考察,构建的体系具备了较好的特异性,从而实现对mcr-1耐药基因更加简便、快捷的检测。