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酸性土壤成分复杂,植物在酸性土壤中生长受到铝毒、低磷、酸害等多种因子的胁迫,其中铝是酸性土壤中限制作物生长的主要因素,其形态随着外界环境的改变而变化。当pH<5时,铝以A13+的形态存在,对植物根系造成危害,影响植物对水分和养分的吸收。虽然对植物的耐铝机制进行了很多研究,但是由于其复杂的物理化学性质,难以进行定位,因而对植物的耐铝机制的认识还很有限,仍处于推理假设阶段,所以还需要在实验中进行更进一步的验证。本研究室在研究丹波黑大豆铝处理SSH cDNA文库中发现bHLH30基因呈上调表达,推测该基因与丹波黑大豆的耐铝性相关。现有的研究表明bHLH转录因子与植物抗逆性、次生代谢、生长发育和形态建成密切相关。但是到目前为止,还没有大豆bHLH转录因子功能的研究。本研究以耐铝能力较强的大豆栽培种丹波黑大豆为材料,分离bHLH30基因,通过构建植物表达载体并转化野生型烟草,鉴定其功能,为研究丹波黑大豆耐铝作用机理奠定了一定的理论基础。主要研究结果如下：运用半定量RT-PCR技术分析了50μM AlCl3处理不同时间的丹波黑大豆和云南小黑豆bHLH30的表达情况,结果表明两种黑豆根中bHLH30的表达量随着50μM AICI3处理时间的增加而增加；其表达量呈先上升后下降的趋势,说明丹波黑大豆bHLH30基因的表达受铝胁迫的诱导。通过克隆50μM A1C13处理8h丹波黑大豆根的bHLH30基因,构建pMD18T-GmbHLH30载体,对其ORF翻译得到的氨基酸序列进行蛋白质同源性搜索,构建bHLH30系统进化树。系统发育分析结果表明bHLH25、bHLH30、bHLH51、bHLH106的系统进化相对独立,bHLH30与bHLH51、bHLH106两类转录因子亲缘关系相对较近,而与bHLH25亲缘关系则相对较远。结构域分析显示GmbHLH30含有碱性区域、HLH区域,说明GmbHLH30蛋白可以结合DNA序列。构建原核表达载体pE728a(+)-GmbHLH30,序列分析发现GmbHLH30基因含有多个稀有密码子,因此导入E. coli Rosetta (DE3)中进行原核蛋白的表达,对表达的重组蛋白进行纯化。GmbHLH30重组蛋白完全以包涵体形式存在,采取割胶纯化的方法,纯化得到的目的蛋白,作为抗原用于抗体的制备。构建植物表达载体pK2-35S-GmbHLH30,转染烟草,在基因组水平、转录水平以及蛋白质表达水平对转基因烟草进行检测,筛选得到阳性表达植株GmbHLH30-10和GmbHLH30-20两个株系。转GmbHLH30基因烟草耐铝生理特性分析结果表明：50μMAICl3胁迫处理24h后,转基因的两个株系GmbHLH30-10和GmbHLH30-20的相对根伸长分别是野生型烟草的2倍和1.75倍；转基因株系根中可溶性糖含量上升,Pro、MDA、H202和PC含量下降,说明铝胁迫下转GmbHLH30基因烟草可以通过维持植物体内渗透压的稳态、较低的膜脂过氧化水平以减少氧化损伤来抵御铝胁迫,从而提高转GmbHLH30基因烟草的耐铝能力。综上所述,丹波黑大豆根中bHLH30基因受铝诱导且呈上调表达,其基因结构含有碱性区域、HLH区域,GmbHLH30蛋白能与DNA序列结合,并调控下游基因表达。转GmbHLJ30基因烟草具有耐铝生理特性,表明GmbHLH30基因具有耐铝功能。