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本文以对甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)具有毒杀作用的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株snf907-76的发酵液为材料,采用现代分离纯化技术对杀线虫活性组分的分离工艺进行探索研究,取得了如下结果:
1.明确了球孢白僵菌snf907-76产生杀线虫活性物质的最佳发酵时间和初步提纯的方法:试验结果表明球孢白僵菌snf907-76杀线虫物质最高产出量的发酵时间为8天,所获得的发酵液活性物质效价(EDso)为0.841 μg/ml。发酵液预处理研究结果表明,无水乙醇直接沉淀法能够有效、快速、简便地除去其中大部分杂质,为分离活性物质奠定了基础。
2.发酵液杀线虫活性物质的理化性质进行了系统研究:在捷克Doskchilova溶剂系统中,杀线虫活性物质的极性较强,在有机溶剂中Rf值很小,具有碱性水溶性抗生素的性质。在Betina溶剂系统中,将其归为I类I a亚类。pH层析试验中,随着pH值的增大,活性物质的Rf值也逐渐增大,曲线呈S行,与碱性抗生素pH层析图谱一致。纸电泳试验中,活性物质在pH=4的缓冲液中,向负极移动,说明其电离后带有正电荷;在pH=8的缓冲液中,不移动,与电泳图谱对照,表明杀线虫活性物质是弱碱性抗生素。理化性质研究表明,该发酵液中的杀线虫活性物质具有耐热、耐酸碱、耐光照、耐贮藏等特,这种杀线虫活性物质具有生产和应用上的优势。
3.对发酵液中活性物质的分离纯化工艺进行了大量研究,通过有机溶剂萃取、活性炭吸附层析、732阳离子树脂交换层析、硅胶层析、Sephadex LH-20层析等方法,最终获得高纯度的杀线虫活性物质。每个步骤都用甘薯摹线虫(Ditylenchus destructor)作活体检测、玻璃板点样检测、薄层层析检测等,防治效价降低。最终分离物通过紫外一可见光谱扫描和高效液相色谱测定其纯度达到100%。
4.活性物质的杀线虫活性测定和抑菌测定表明,其对甘薯茎线虫、北方根结线虫、胞囊线虫、秀丽小杆线虫、水稻干尖线虫具有致死作用;对黄瓜菌核病菌、茄腐镰刀病菌、尖孢镰刀病菌、玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、水稻纹枯病菌、烟草赤星病菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌都有抑菌作用。