论文部分内容阅读
HDN-1是本研究室从一株南极来源树粉胞属真菌Oidiodendron truncatum GW3-13次级代谢产物分离得到的,属于含有新颖三硫桥结构的epipolythiodioxopiperazine (ETP)类化合物。五株人癌细胞活性测试表明,该化合物对肿瘤细胞具有较强的细胞毒活性。特别是在20nM浓度下,可以诱导M2型白血病细胞HL-60分化与凋亡,且对正常白细胞活力和小鼠体重无明显影响；分子机制研究表明,HDN-1是一种作用于HSP90 C端的抑制剂。目前,HDN-1已作为新型靶向抗肿瘤药物做新药研究开发。本研究内容重在通过新型高产培养基开发、发酵条件优化及5L罐体优化等工艺研究提高HDN-1的产量,并建立HDN-1制备工艺,为后续药理学研究、毒理学研究及动物实验奠定基础。我们首先考察了培养温度及发酵初pH、摇瓶装液量和摇床转速对该菌株生产HDN-1产量的影响。摇瓶实验提示,25℃为最适发酵温度。摇瓶发酵初始pH实验表明菌株GW3-13最适生长pH为5.0。在500m1三角瓶中装液100m1有利于菌株产HDN-1,转速为180r/min较为适宜菌株生长。通过单因素实验确定了三种较优碳源(葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉)和氮源(酵母膏、蛋白胨、玉米粉)。采用八因素十水平的均匀设计实验确定了培养基成分之间的配比,得到了一个可用模型及培养基组成。在均匀设计的基础上,利用Plackett-Burman设计筛选了三个显著因子(葡萄糖、酵母膏、MgSO4·7H2O)。通过响应面设计(Response surface methodology)的Box-Behnken实验优化了三因子之间的配比,开发了一种新型高产HDN-1培养基组成和配比,在此条件下,摇瓶培养HDN-1最大产量为54.7mg/L,比初始产量提高了9.6倍。模拟剪切力及消泡剂对HDN。1的影响实验表明,该菌株对剪切力不敏感：实验采用的消泡剂(体积分数在2%之内)不影响产物产量。结合以上结果,5L发酵罐重点研究了不同通气量、补料、间歇控制pH、不同桨叶组合等因素,结果表明通气1vvm条件下,产物产量和菌体干重均高于通气0.5wm,提示较高的通气量可以促进菌体生长及产物形成；间歇控制pH实验表明,整个发酵过程中不调整pH,保持初始pH为5.0对该菌株产HDN-1有利；一次性补加碳源的补料方式,产物最大产量为39.4mg/L,对产物产量稍有促进作用；不同桨叶组合实验表明,下层四斜叶桨上层六平叶涡轮桨叶的组合对菌体生长和HDN-1的产量无显著影响,菌体形态观察表明松散稀疏状态有利于菌体生物量积累和产物合成,HDN-1的最大产量为42.1mg/L,菌体最大干重达到15.29g/L。与上下均为六平叶涡轮桨叶不同的是,氧消耗的速度增加,提示可以通过这种组合提高气液混合度。开发了一套完整、高效的HDN-1制备分离流程,提高了化合物分离纯化的效率。