盾叶薯蓣扩展蛋白基因克隆及表达分析

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盾叶薯蓣是我国特有种,有重要的药用价值,其薯蓣皂苷元(俗称皂素)含量居薯蓣属植物首位。薯蓣皂苷元是多种激素类药物的原材料,其全球需求量很大。盾叶薯蓣不同组织、不同发育阶段所含薯蓣皂苷元均有差异,以根状茎中含量最高。目前薯蓣皂苷元的研究多集中于代谢通路中关键基因的挖掘,对其生长发育过程关注较少。膨胀素是一种可使植物细胞壁发生松弛的活性蛋白,通过参与细胞伸长和细胞壁的修饰过程在植物生长发育过程中发挥关键作用。但其在盾叶薯蓣不同组织膨大、伸长过程中的作用鲜有研究。本文利用RACE克隆技术获得盾叶薯蓣膨胀素基因(Dz EXP)序列全长;使用在线网址及软件对其核酸、蛋白序列及蛋白结构进行分析;将Dz EXP基因插入p CXUN-YFP载体后转化水稻原生质体,使用激光共聚焦显微镜观察Dz EXP蛋白亚细胞定位情况;将Dz EXP基因插入载体p ET-28b-MBP-BST,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行原核表达,SDS-PAGE电泳观察其可溶性,并利用亲和层析法对蛋白进行纯化及Western blot检测;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)对Dz EXP基因进行差异性表达分析。实验结果具体如下:1.利用简并引物PCR扩增得到Dz EXP基因核心序列,通过RACE试剂盒获得5’、3’末端,拼接得其全长为1216 bp,ORF框长度为630bp,编码209个氨基酸。系统进化树分析发现其与凤梨(Ananas comosus)亲缘关系最近。结构分析表明,Dz EXP蛋白为不跨膜蛋白,有DPBB-1(Rare lipoprotein A(Rlp A)-like double-psi beta-barrel和Pollen-allerg-1结构域,属于α-expansin(EXPA)亚家族。亚细胞定位发现,Dz EXP蛋白定位在细胞膜上。2.获得p ET28b-MBP-Dz EXP表达载体,转入BL21(DE3)菌株原核表达,电泳显示产物是可溶性蛋白。3.基因差异性表达分析显示,Dz EXP基因在盾叶薯蓣不同组织中都有表达,嫩叶和嫩根状茎中表达量较高;叶片喷施10μM Me JA诱导,8 h时表达量最高,以后开始下降。
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