【摘 要】
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细菌及病毒感染是困扰人类很久的问题,尤其是近年来由于抗生素不规范使用及细菌突变等多方面原因,耐药菌的感染成为日益严重而急需解决的一个难题。内源性抗菌肽是一类阳离子
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细菌及病毒感染是困扰人类很久的问题,尤其是近年来由于抗生素不规范使用及细菌突变等多方面原因,耐药菌的感染成为日益严重而急需解决的一个难题。内源性抗菌肽是一类阳离子短肽,广泛分布于人体多个部位,具有广谱抗微生物活性,在不久的将来可能作为新一代抗感染药物代替传统抗生素。防御素是人体中一类重要抗菌肽,新近的研究发现该类分子还是一种多功能免疫活性肽,广泛地参与了机体的免疫应答。本研究应用重组嵌合蛋白技术试图改造抗菌肽以提高抗菌活性和稳定性,构建抗菌肽嵌合核酸疫苗以增强抗肿瘤免疫。 本文分三个部分。 第一部分是对本实验室从人子宫颈粘液中分离鉴定出的1个新抗菌肽进行N-端氨基酸序列测定和cDNA克隆,获得其全长编码基因,以便用作嵌合肽的构建。测序结果显示氮端氨基酸序列从第一至第十位依次为脯氨酸(Pro,P),赖氨酸(Lys,K),精氨酸(Arg,R),赖氨酸(Lys,K),丙氨酸(Ala,A),天冬氨酸(Asp,D),甘氨酸(Gly,G),谷氨酸(Glu,E),丙氨酸(Ala,A),赖氨酸(Lys,K)。根据其氮端氨基酸序列,设计简并引物,3’-RACE-PCR技术扩增出全长cDNA,通过BLAST程序检索对比分析,确定其为高迁移率蛋白N2(High mobility group chromosomal protein N2, HMG N2),用蛋白质二结构软件分析发现该分子含1个跨膜α-螺旋结构域,位于该分子氨基酸序列的第17位至42位之间。化学合成该分子N-端、α-螺旋和C-端肽片段,抗菌活性检测显示仅α-螺旋肽片段具有抗菌活性,证明α-螺旋是HMG N2抗菌功能结构域。 第二部分是构建HMG N2 α-螺旋结构域与富组蛋白-5嵌合抗菌多肽。采用PCR拼接技术将二者连接起来,构建出融合肽原核表达质粒
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