论文部分内容阅读
Fc受体(FcR)为特异亲和免疫球蛋白(Ig) Fc片段的细胞表面分子,广泛表达于免疫细胞表面,具有许多重要的生理功能,是体液免疫与细胞免疫的联系纽带,在机体免疫调控中起关键作用。目前人和小鼠的三类IgG Fc受体(FcγRI、FcγRII和FcγIII)研究最为深入。本研究克隆和鉴定了猪IgG三类Fc受体;研究了PRRSV变异毒株和经典毒株感染后活化性Fc受体和抑制性Fc受体的转录动态差异及与免疫抑制的关系;构建了稳定表达猪FcγRII的Marc-145细胞系,研究了该受体在介导PRRSV ADE中的重要作用。用人CD64氨基酸序列检索NCBI的EST数据库(包括除人和老鼠以外的所有物种核苷酸序列)(tBLASTn),发现了6个猪的高同源overlapping序列,利用这些序列信息设计引物,采用RT-PCR从猪外周血白细胞中扩增到了猪FcγRI cDNA序列,命名为poFcγRI。poFcγRI ORF全长1038 bp,编码346氨基酸的糖蛋白。胞外区包括三个Ig样结构,有4个N-糖基化位点。poFcγRI和人、牛与老鼠的FcγRI在氨基酸水平上分别有79%、69%和57%的相似性。胞外环区相似性较高,分别为77%、74%和70%,这提示人、牛、猪、鼠的FcγRI和IgG的结合域高度保守。随后,RT-PCR检测到了poFcγRI mRNA在巨噬细胞、单核细胞中表达量较高,在多形核细胞中也有表达,在淋巴细胞中没有表达,和人与小鼠CD64的表达谱类似。将poFcγRI ORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA构建成重组质粒pcDNA/poFcγRI,再用脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环实验鉴定了poFcγRI配体亲和特性。对猪IgG Fc受体的进一步研究发现猪IgG Fc受体共由三类分子组成,即FcγRI、FcγRII和FcγIII,克隆了这三类受体cDNA,其中FcγRII胞内区有保守的ITIM基序,为抑制性受体;FcγRI和FcγRIII胞内区没有发现已知的信号传导基序,通过γ链的ITAM基序进行信号转导,因而这两个受体为活化性受体。发现FcγRII至少存在两个亚类,即FcγRIIB1和FcγRIIB2,FcγRIIB1胞内区有一插入序列,使胞内区由47个氨基酸延长到99个氨基酸。这两个亚类胞内区均存在ITIM基序,因此均为抑制性受体。活化型受体和抑制型受体共表达于免疫细胞表面,共同调节抗体对免疫细胞的活化作用。抗原抗体复合物和免疫细胞表面的活化型受体给合,能活化免疫效应细胞,诱发多种免疫学效应。抑制型受体的作用刚好相反,通过免疫复合物与抑制型受体交联,抑制活化受体介导的细胞活化。研究PRRSV感染后活化型和抑制型Fc受体的转录动态,对于揭示PRRSV感染引起的免疫抑制有重要意义。通过Real-time PCR检测不同毒株PRRSV感染后猪体活化性和抑制性Fc受体的转录动态,发现PRRSV感染后活化性受体FcγRI和FcγRIII均迅速下调,而抑制性Fc受体FcγRII感染后有轻微上调。PRRSV感染后机体能够快速诱导产生高水平的特异性抗体,但感染后活化性Fc受体下调导致抗体和抗原抗体复合物不能活化免疫效应细胞,从而引起细胞免疫功能下降,这是PRRSV感染引起免疫抑制的分子基础。抗体依赖增强作用(ADE)是PRRS防控中遇到的最大的难题之一。本研究将猪FcγRII基因转染Marc-145细胞,通过G418连续筛选和克隆获得了稳定表达猪FcγRII的Marc-145细胞系。用PRRSV BJ-4株与1:320稀释的抗PRRSV IgG感染克隆化的Marc-145细胞系,在有抗体存在的情况下PRRSV感染收获的病毒量明显高于对照组,证明了poFcγRII能够介导PRRSV ADE作用。在PRRSV免疫效果评价当中,现有的评价标准是测定疫苗免疫后的PRRSV特异性抗体。但ADE作用的存在使PRRSV特异抗体在特定情况下不仅没有保护作用,反而有助于感染。本研究构建的稳定表达猪FcγRII的Marc-145细胞系能够方便的评价抗体的ADE作用,从而为研制高效PRRSV疫苗提供技术支持。