研究背景：　　手足口病（Hand，Foot and Mouth Disease，HFMD）是儿童常见的传染病之一。引起该病的肠道病毒以肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus Al6，CoxA16）最为常见。CoxA16病毒所致HFMD症状相对较轻，一般不合并严重的并发症，疾病过程多为自限性。EV7引起的HFMD则较为严重，可以导致严重的神经性疾病如急性肺水肿、急性迟缓性麻痹等。　　近年来，手足口病在世界各地均有流行，东南亚、中国台湾及我国大部分省份也有流行，且呈上升趋势。目前，针对EV71感染的细胞受体和宿主因子已获识别，但多种证据表明：清道夫受体B2（Scavenger receptor class B member2，SCARB2）在EV71的感染和致病中起关键作用。　　清道夫受体B2是葡萄糖脑苷酯酶的一种特异结合配体，是内吞高密度脂蛋白和致病细菌内摄的一种膜蛋白，归属于清道夫受体B类亚科家族，该亚科包括SCARB1和SCARB2，SCARB2是一个相对分子量为85kDa的Ⅲ型跨膜的唾液酸糖蛋白。人scarb2基因位于第4号常染色体上，编码一个含478个氨基酸前体的肽链，研究表明SCARB2主要位于溶酶体和内涵体上并参与膜运输和内涵，目前有报道 SCARB2亦广泛存在于细胞膜上，参与 EV71感染与致病过程；另外SCARB2也可作为CoxA16的受体，与CoxA16引起的手足口病密切相关。由于目前尚无有效治疗手足口病的抗病毒药物，临床只能对症治疗。因而研制安全有效的疫苗、以及抗病毒药物对于防治手足口病，特别是EV71引起的手足口病意义重大。本研究建立了清道夫受体B2蛋白的原核表达系统，并对该蛋白进行了表达产物和免疫原性鉴定，为EV71疫苗和抗病毒药物的研究提供了可供选择的靶点。　　研究目的：　　用原核表达系统表达清道夫受体B2蛋白，并进一步鉴定表达产物及其免疫原性，为EV71疫苗和抗病毒药物的研究提供选择靶点。　　研究方法：　　1、培养 RD细胞：复苏人横纹膈肌肉瘤细胞（RD细胞），购于中国科学院上海细胞库，将细胞用5ml含10％胎牛血清、1%双抗的完全DMEM培养基于37℃，5% CO2二氧化碳培养箱中培养。　　2、RD细胞总RNA的抽提和PCR扩增：用宝生生物工程有限公司RNA抽提试剂盒，依照说明书从培养的RD细胞中抽提总RNA，利用Primer Premier5.0软件设计清道夫受体B2的引物，反转录和PCR扩增用宝生生物工程（大连）有限公司的RNA LA PCR Kit（AMV）Ver.1.1进行。　　3、目的基因与表达载体的连接：将目的基因scarb2与表达载体pET28a（+）连接，然后将重组质粒转入 BL21（DE3）大肠杆菌宿主，用异丙基硫代半乳糖苷诱导。　　4、表达蛋白的鉴定与纯化：表达的重组蛋白SCARB2用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行初步鉴定，符合目的蛋白大小后用His单抗及蛋白质谱分析进一步对表达的蛋白进行鉴定，用切胶回收的方法纯化重组蛋白。　　5、表达蛋白的活性鉴定：用纯化的重组蛋白SCARB2分别与EV71病毒和表达的VP1蛋白进行ELISA反应，验证表达蛋白的活性。　　6、表达蛋白免疫BALB/c小鼠：用纯化的重组蛋白SCARB2免疫BALB/c小鼠，ELISA检测免疫鼠血清抗体滴度，蛋白免疫印迹（Western Blot）验证重组蛋白SCARB2的抗原性。　　7、体外中和实验：取目的蛋白免疫的小鼠血清，56℃、30min灭活补体后与96孔板中的RD细胞在37℃、5%二氧化碳培养箱中反应2h，加入200TCID50 EV71病毒，于培养箱中培养7天后观察免疫的小鼠血清有无中和EV71病毒的作用。　　研究结果：　　1、将RD细胞中抽提的总RNA反转录成cDNA，利用特异性引物扩增出1500bp大小的scarb2基因。　　2、成功构建重组质粒pET28a（+）-SCARB2，将此重组质粒转入BL21（DE3）大肠杆菌宿主后，成功表达重组SCARB2蛋白，其分子量约为55kDa。　　3、重组SCARB2蛋白的鉴定：重组SCARB2蛋白与His单抗反应结果呈阳性。蛋白质谱分析显示，表达的重组蛋白为SCARB2蛋白。　　4、重组SCARB2蛋白成功免疫BALB/c小鼠，Western Blot证实其具有良好的抗原性。　　5、体外中和实验结果显示：表达的重组 SCARB2蛋白免疫小鼠后，其血清具有中和EV71病毒的作用，中和抗体的滴度为1:256。　　研究结论：　　1、本研究成功构建了SCARB2蛋白的原核表达系统，并成功表达了SCARB2蛋白。　　2、本研究表达的SCARB2蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。　　3、本研究表达的SCARB2蛋白免疫小鼠后，其血清具有中和EV71病毒的作用，且中和抗体的滴度为1:256。