【摘 要】
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Micro RNA（miRNA）是一类19～24 nt的非编码小分子RNA,由一段具有发卡结构的单链RNA前体剪切后生成,在植物的生长发育和胁迫响应中发挥重要作用。目前关于植物与病虫害相关miRNA的研究很多,尤其在拟南芥、烟草、二穗短柄草等模式植物以及水稻、玉米、大麦等农作物中。但是,农作物青稞与病虫害相关的miRNA的研究目前没有报道。而在青稞的所有病虫害中,条纹病是危害青稞产量的主要真菌病害
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Micro RNA（miRNA）是一类19～24 nt的非编码小分子RNA,由一段具有发卡结构的单链RNA前体剪切后生成,在植物的生长发育和胁迫响应中发挥重要作用。目前关于植物与病虫害相关miRNA的研究很多,尤其在拟南芥、烟草、二穗短柄草等模式植物以及水稻、玉米、大麦等农作物中。但是,农作物青稞与病虫害相关的miRNA的研究目前没有报道。而在青稞的所有病虫害中,条纹病是危害青稞产量的主要真菌病害之一。本研究通过青稞miRNA数据库构建与验证实验相结合的方法,挖掘、预测及鉴定了青稞中与条纹病密切相关的miRNA,并对这些miRNA进行了相关功能分析,发现hvu-mi R168-5p及其预测靶基因hvu-AGO1在青稞抗条纹病中的靶向关系。高通量测序结果表明hvu-mi R168-5p在青稞感病品种“1141”和青稞抗病品种“昆仑14”感染条纹病后的表达量上升。本研究同时克隆了hvu-mi R168-5p的预测靶基因hvu-AGO1,并且发现hvu-AGO1基因的表达量在青稞感病后下降。半定量PCR结果显示,hvu-mi R168-5p与hvu-AGO1基因的表达量呈负相关,符合miRNA与靶基因的调控模式。研究结果不仅加深对青稞抗条纹病机制的了解,同时也为青稞的抗条纹病育种研究奠定基础。主要研究如下:（1）实验室条纹病病原菌侵染体系的构建:（1）选取青稞抗病品种“昆仑14”、“昆仑15”和感病品种“1141”和“1140”的感病叶片,将处理过的感病叶片3-4片（5×5mm）放在PDA培养基中培养7天;（2）用打孔器打菌饼放在新的PDA培养基中,22-25℃生化培养箱中培养,约6-8天菌落长满整个培养皿。（3）青稞种子用75%酒精处理1min后,放在长满菌的培养皿中,6℃低温培养15天。（4）将营养土放置花盆中,做好标记,将种子种在花盆中,放在人工气候培养箱中培养（白天14h,20℃;黑夜10h,10℃）,10天后即可观察到感病情况,整个过程需要约40-45天。（2）青稞抗条纹病miRNA筛选:经miRNA-seq青稞miRNA数据库构建分析“昆仑14”和“1141”品种感病前后miRNAs,发现92个青稞的miRNAs,其中36个为已报道的miRNAs,另有56个为新发现的miRNAs。青稞条纹病感染前后表达量差异显著的miRNA共35个,通过对比这些miRNAs在抗病品种“昆仑14”和感病品种“1141”中的差异,发现四个关键的miRNAs:两个已知的miRNA（hvu-mi R168-5p和hvu-mi R6198）和两个未知的miRNA（novel-11和novel-91）。使用统计学软件Stst2与SPSS13.0进行方差分析和多重比较发现它们在感病前后的表达量差异极显著（P＜0.01）。（3）hvu-mi R168-5p的靶基因预测分析:利用植物miRNA靶基因在线预测软件ps RNATarget,同时经过生物信息软件分析和查阅文献挖掘到hvu-mi R168-5p的靶基因hvu-AGO1。推测hvu-mi R168-5p可能通过调控靶基因hvu-AGO1的表达而参与青稞抗条纹病的过程。（4）研究候选miRNA及其靶基因的关系:利用RT-PCR,结合RACE技术,克隆靶基因hvu-AGO1,获得靶基因hvu-AGO1的3’RACE、完整CDS及同源5’RACE片段。通过高通量测序结果表明青稞抗病品种“昆仑14”和青稞感病品种“1141”感染条纹病后hvu-mi R168-5p的表达量上升及通过半定量PCR技术确定靶基因hvu-AGO1的表达量下降,因此,预测hvu-mi R168-5p与靶基因hvu-AGO1呈负相关。
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