根据伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因保守序列,设计合成一套特异引物和TaqMan探针,建立了一种快速、敏感和特异的检测伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR方法。该方法灵敏度高,可检测到相当于10拷贝/μL的病毒DNA,比常规PCR检测方法高约100倍。该方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应。该方法变异系数小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于伪狂犬病毒经典株和变异株的检测和定量。为了研究猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)的免疫原性,确定其对猪的最小免疫剂量,进行了仔猪免疫攻毒试验。25头2周龄PRV抗原和抗体阴性的健康仔猪,随机分为5组,每组5头。第1—4组分别颈部肌肉注射猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)0.5 mL、1 mL、2 mL和3 mL,28天后每组用同等剂量疫苗加强免疫一次,第5组为对照组。各组猪在免疫后,每周采集血清检测PRV gE和gB抗体水平。第二次免疫后第28天,所有猪用105.0 TCID50的猪伪狂犬病毒强毒(JS-2012株)滴鼻接种。攻毒后,每天测量体温并记录临床症状,14天后剖解,观察病理变化。结果显示,第一次免疫后14天,第2—4组猪PRV gB抗体全部转为阳性,而第1组猪在第一次免疫后21天全部转阳。猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)1 mL、2 mL和3 mL免疫都能为仔猪提供良好的保护,免疫猪在攻毒后除了表现为一过性的发热外,没有明显的临床症状和病理变化。而0.5 mL免疫组有1头猪表现为精神沉郁、厌食和轻微的神经症状,其余4头只有一过性的发热。对照组猪在攻毒后表现为高热(41℃以上)、精神沉郁、厌食和严重的神经症状,脑和肺部表现为出血等明显的病理变化,有2头死亡。基于以上结果,确定猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)的最小免疫剂量为1 mL。为满足动物福利要求,在成品疫苗免疫效力评价中减少本体动物的使用,本研究尝试使用小鼠评价了猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)免疫效力,共进行了两次小鼠免疫攻毒试验。45只6周龄昆明小鼠,随机分为5组。第1—4组每组10只,每组分别皮下注射猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL和0.3 mL,28天后每组用同等剂量疫苗加强免疫一次。第二次免疫后第21天,连同第5组5只对照小鼠,皮下注射猪伪狂犬病毒强毒(JS-2012株)的病毒培养液0.1 mL(含50 LD50)。攻毒后,每天记录小鼠的发病、死亡情况。结果显示,攻毒后,0.05 mL和0.1 mL免疫组分别有3只和2只小鼠死亡,0.2 mL和0.3 mL免疫组小鼠全部存活,对照组小鼠全部死亡。为了验证用小鼠评价猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)的可靠性,本研究重复了一次小鼠免疫攻毒试验,并且在攻毒后第10天每组随机抽取5只小鼠进行剖解,观察病理变化,并提取脏器组织DNA,用前面建立的荧光定量PCR方法检测病毒核酸。结果显示,对照组病毒核酸含量最高,小鼠全部死亡,而其它免疫组小鼠只检测到少量或没有检测到病毒核酸,所有免疫组小鼠全部存活。两次小鼠试验存活率存在一些差别,这可能与免疫和攻毒操作的精准度相关。但总的来说,随着免疫剂量的提高,小鼠的发病率和死亡率随之降低,这与猪的试验结果是一致的。因此,用小鼠替代仔猪对猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)进行免疫效力评价是可行的。