血管生成是多数情况下血管新生的重要方式——从创伤愈合到特定性生理周期（女性月经周期），从多种人类疾病的发生到肿瘤的生长和转移，血管生成参与众多重要生理性和病理性过程。血管生成是由多步骤组成的复杂过程：首先细胞外基质（Extracellularmatrix, ECM）发生降解，接着血管内皮细胞（Endothelial cells, ECs）从已有血管中出芽，随后ECs经历增殖、迁移、分化而形成血管，最后平滑肌细胞被募集至新生的血管上。ECs不仅是构成血管的重要组成部分，更是血管生成过程重要的“执行者”。近年来随着体外血管生成体系的应用、体内基因剔除/敲入小鼠模型的建立，对血管生成机制的研究也不断深入，发现多条信号途径在细胞、分子水平调控血管生成和ECs功能。Notch信号途径因参与调控ECs的多种功能，决定ECs的命运，而成为备受关注的调控信号。Notch信号途径是进化中高度保守的、通过细胞与细胞之间直接接触而激活的信号途径，参与调控包括细胞增殖、分化、凋亡、命运决定等多种重要过程。当相邻细胞间Notch配体与其受体接触时，Notch受体的胞内段（Notch intracellular domain, NIC）就会释放进入细胞核，与核内DNA结合蛋白——重组信号结合蛋白-J（Recombination signal binding protein-Jκ,RBP-J）结合，从而激活下游基因的转录。在缺少NIC的情况下，RBP-J则通过募集多种转录共抑制分子而发挥抑制转录的作用。本室前期研究发现：RBP-J可通过与LIM蛋白KyoT2结合而募集多种转录共抑制分子。但是，KyoT是由选择性拼接形成的分子亚家族，与RBP-J结合的只有KyoT2吗？是否还有其它KyoT分子能和RBP-J结合？这种结合对Notch信号途径有什么样的调控作用？对ECs的功能又有怎样的影响？基于上述设想，本课题发现了KyoT另一个剪接变异体KyoT3，深入研究了与RBP-J结合的LIM蛋白家族KyoT3的组织分布与细胞定位，寻找其与RBP-J结合的直接证据，阐明KyoT3对Notch信号途径的调控作用，探究KyoT家族成员对ECs的功能的影响。主要研究结果如下：1.发现了KyoT家族的新异构体。首先，通过以小鼠胚胎cDNA文库为模板，经聚合酶链反应（Polymerasechain reaction, PCR）获得KyoT家族另一剪接变异体，KyoT3。KyoT3，其全长为969bp，编码包含323个氨基酸的大小为36.26KD的蛋白质。KyoT3的N-端是与KyoT1相同的3个半LIM结构域，在LIM结构域之后为KyoT1所不具备的3个核定位信号（Nuclear localization signals, NLS）和1个出核序列（Nuclear export sequence, NES）。与KyoT2相同的是：KyoT3也拥有由C-端27个氨基酸构成的RBP-J结合基序，这提示KyoT3可能也具有与KyoT2相似的功能。利用位于KyoT3序列上的酶切位点XhoⅠ，将KyoT3分为前后2段，通过对2段分别扩增后再拼接的方式，在不改变KyoT3序列、不引入新碱基的情况下，成功构建pMD18-T-KyoT3，为进一步研究KyoT3的功能打下基础。其次，探明了KyoT3在组织中的分布和细胞内的定位，并确认其在细胞核内的定位依赖于其NLS。提取小鼠不同组织器官的RNA，经过反转录为cDNA之后，采用KyoT3特异性引物，通过PCR的方法研究KyoT3在组织内的分布，发现KyoT3的mRNA在小鼠脾脏、胸腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、心脏、大脑、胎盘、肺脏、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺都有表达，说明其组织分布十分广泛。为明确KyoT3在细胞内的定位，构建了含KyoT3全长的pEGFP-C2-KyoT3和pEGFP-N1-KyoT3；仅含NLS的pEGFP-C2-NLS和pEGFP-N1-NLS；不含有NLS的pEGFP-C2-KyoT3N和pEGFP-N1-KyoT3N质粒。Western blot的方法发现其中C2-KyoT3N的表达量很低后，通过其它5种质粒分别转染HeLa细胞，而确定了KyoT3主要分布于细胞核内，并且KyoT3在细胞核内的定位是依赖于其3个串联的NLS实现的。最后，通过免疫共沉淀验证了KyoT3与RBP-J之间的相互作用，并进一步明确了KyoT3具有抑制RBP-J依赖的转录的作用。构建了带Myc标签的pCMV-Myc-KyoT3真核表达质粒，通过与带Flag标签的pCMV-RBP-J-Flag共转染HeLa细胞的方式，采用免疫共沉淀实验，利用不同的抗体检测，确认了KyoT3和RBP-J之间存在物理相互作用。随即使用双荧光报告基因系统，在HeLa细胞和HEK293细胞内证实KyoT3具有抑制RBP-J依赖的转录的作用，并且这种作用具有剂量依赖效应。此外，通过将KyoT3与NIC质粒共转染HeLa细胞，24h后用实时定量PCR的方法检测下游基因Hes-1的mRNA水平的方法，结果也表明：共转染KyoT3和NIC时，KyoT3能显著抑制NIC激活的Hes-1的转录。2.阐明KyoT家族成员对血管内皮细胞的影响。首先，成功分离和培养人脐静脉内皮细胞（Human umbilical veinendothelial cells, HUVECs），在其中检测到KyoT家族成员KyoT2的表达。为研究在血管生成中KyoT家族成员的作用，在本室建立了HUVECs的分离、培养的方法，并通过其形态表现为典型的铺路石样、表面CD31分子表达平均约为99%、具有形成管腔的能力，对分离、培养的细胞进行了确认。通过PCR的方法检测HUVECs中KyoT家族成员的表达。结果发现：在HUVECs中仅KyoT2表达，于是将研究聚焦于KyoT2。其次，发现转染KyoT2能使HUVECs细胞系（HUVEC Cell line,HUVEC-CL）中管腔形成增多，tip细胞的数目增加，细胞增殖减少。在后续的实验中，使用脂质体LTXPLUS瞬时转染EGFP-KyoT2于HUVECs和HUVEC-CL，通过计数绿色细胞总数的方法，发现：无论在HUVECs或是HUVEC-CL中，与转染EGFP的对照组相比，转染KyoT2后细胞增殖减弱，然而转染KyoT2却能使HUVEC-CL中管腔形成增多，tip细胞的数目增加。通过本课题的研究证实：KyoT另一剪接变异体KyoT3的存在，并明确了其在组织中的分布和细胞内的定位，并且KyoT3在细胞核内的定位是依赖于其3个串联的NLS的。KyoT3能够与RBP-J发生物理上的相互作用，也因此参与了RBP-J介导的Notch信号途径的调控。KyoT3能够抑制RBP-J介导的转录激活，并且这种抑制作用具有剂量依赖效应。为研究KyoT家族成员在血管生成中的作用，在本室建立了HUVECs的分离与培养方法，通过该方法能够获得纯度高、功能好的HUVECs，作为研究ECs的模型。使用PCR的方法，检测到仅KyoT2在HUVECs内的表达，因此也将研究重心转移到KyoT2对ECs的功能影响。进一步研究发现瞬时转染KyoT2能够抑制ECs增殖，促使管腔形成增多，tip细胞的数目增加。为更深入地研究KyoT2在血管生成过程中的作用奠定基础。