【摘 要】
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外源基因的序列结构是影响外源基因在大肠杆菌中表达的重要因素,研究人员采用基于"外源基因全序列结构优化"的表达策略,研究了HIV-1gp120-801和霍乱毒素A亚单位(CTA-246)基因
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院
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外源基因的序列结构是影响外源基因在大肠杆菌中表达的重要因素,研究人员采用基于"外源基因全序列结构优化"的表达策略,研究了HIV-1gp120-801和霍乱毒素A亚单位(CTA-246)基因大大肠杆菌中的表达情况.以绿色荧光蛋白(GFP)为标记蛋白,将其基因克隆至pUC18质粒构建了筛选载体pUC18-GFP.外源基因从GFP基因的5′端重组进筛选载体、转化大肠杆菌,如果一个重组质粒可以表达外源蛋白与GFP的融合蛋白,含此重组质粒的转化菌,落在紫外光下将会发出绿色的荧光.据此能够筛选到可在筛选载体中表达的外源基因.用DNA重排的方法构建了gp120-801(编码HIV-1gp120 215-481痊氨基酸)基因的全基因随机突变文库.用筛选载体pUC18-GFP从中得到了gp120-801的一个突变基因(mutgp120-801).mutgp120-801基因有六外发生了突变,其中有一外突变导致了氨基酸的改变.这个氨基酸的变化发生在gp120蛋白的一个氨基酸高变区域内,不影响原型gp120-801编码蛋白的主要抗原性.mutgp120-801在pEX31b载体中的表达量可达到15%,而gp120-801的表达量低于1%.免疫印迹实验和ELISA实验表明,mutgp120-801表达产物可以和HIV-1阳性血清发生特异性的免疫反应.构建了CTA-246(编码CTA 171-252位氨基酸)的全基因密码子简并突变文库.用筛选载体pUC18GFP从中得到了两个阳性表达克隆.但可能由于编码产物对宿主的毒性,造成了外源基因的高突变率,未能直接获得突变基因.该研究结果表明了用"用外源基因全基因结构优化"的策略实现外源基因在大肠杆菌中高表达的可行性,为外源基因在大肠杆菌中的高表达研究提供了一条新的途径.
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