论文部分内容阅读
外界病原微生物可以从机体的不同部位侵入,并通过各种机制诱发疾病的产生。当外界致病微生物穿越了人体的上皮屏障,并在宿主的组织内开始大量复制时,会被定居在组织中的单核吞噬细胞以及巨噬细胞所识别。巨噬细胞在机体遭遇病原微生物的入侵时能够迅速做出反应,一方面进行吞噬病原体,另一方面能够释放大量的效应分子引起组织内的炎症反应,进而控制感染。机体的免疫系统对抗原识别过程依赖于不同模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)来完成的,如TLR(sToll like receptors)、NLRs (NOD-like receptors)、RLH(RIG-like helicases)等。Toll样受体作为先天性免疫系统中的重要组成部分,主要通过识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)来启动免疫反应,进而清除外来抗原。脂多糖LPS(lipopolysaccharide)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,能够引起多种免疫细胞发生形态、功能以及胞内基因表达的变化,并导致宿主细胞因子失控性地表达,介导严重感染、器官损伤以及败血症休克等多种疾病的产生。研究表明,LPS能够被细胞表面的TLR4分子所识别,并将信号传递至胞内,激活下游的多条信号,如MAPK(Mitogen activated protein kinase)、NF-κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、AKT/PKB等信号途径,引发细胞产生一系列的固有免疫分子,如细胞因子(cytokine)和趋化因子(chemokines),包括IL-1(Interleukin-1)、TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、IL-6 (Interleukin-6)、IL-12(Interleukin-12)及趋化因子IL-8 (Interleukin-8)等等。TLR家族不仅能够启动天然免疫应答,控制炎症反应的性质、强度以及持续时间,还可以通过上调抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC)表面的共刺激分子以及MHCⅡ的表达,促进APC的成熟,参与抗原特异性免疫应答,尤其是Th1型反应的产生,调节获得性免疫应答的强度以及类型,成为连接天然免疫(innate immunity)和获得性免疫应答(adaptive immunity)的枢纽。但是,TLR信号过度活化或着活化不足,都会导致机体功能异常以及疾病的发生,因此其调控过程受到其它很多信号通路的正向或负向调控,使之维持适度的活化平衡。在LPS诱导的TLR4信号转导途径中,多种蛋白参与其调节过程。目前只是对其中一些关键的分子研究的较深入。LPS刺激细胞能够引起众多基因表达量的变化,参与其信号调节过程。如何筛选到这些基因以及探索其功能仍是任重道远。本课题组通过对比小鼠活化与非活化状态的脾细胞EST数据库,筛选到一些在可能在免疫系统中具有潜在功能的基因。并针对其中的部分基因做了一定的研究。本文重点介绍Rab10、Sik1这两个基因。实验通过LPS刺激树突状细胞(dendritic cell,DC),发现随着LPS刺激时间的不同,Rab10及Sik1都呈现一定的变化趋势,暗示Rab10及Sik1在可能在免疫调节中扮演一定的角色。在Rab10基因的研究过程中,实验通过构建了Rab10过表达的质粒在RAW264.7细胞、原代巨噬细胞中瞬时过表达Rab10以及构建了Rab10稳定沉默的细胞系Rab10iA及Rab10KD251,在体外研究Rab10在免疫调节中的功能。最后通过小鼠急性肺损伤模型在体内验证了Rab10在免疫系统中可能的功能。研究结果表明,Rab10蛋白在LPS诱导的TLR4信号转导过程中具有重要的作用。Rab10蛋白能够提高IFN-?、NF-κB启动子的活性,增强MAPK、NF-κB、IRF3信号途径,上调LPS诱导的相关细胞因子如TNF-a、IL-6、IFN-?等的表达,其具体机制是通过辅助TLR4从高尔基体转运至细胞膜,增强LPS诱导的TLR4信号转导途径,从而调节免疫应答。在Sik1基因的研究过程中实验构建了Sik1过表达以及RNA干扰的腺病毒载体,在RAW264.7中过表达Sik1以及在DC细胞中进行RNA干扰等实验。研究结果表明,SIK1蛋白能够增强LPS诱导的MAPK、NF-κB信号途径,提高NF-κB的转录活性,促进促炎症因子IL-6、IL-12、TNF-a的表达,抑制抗炎因子IL-10的表达。