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研究背景随着抗菌药物的广泛使用,细菌耐药已成为全球严峻的公共卫生问题。近年来,革兰氏阴性杆菌对临床常见抗菌药物的耐药率呈增长趋势,其中最多见者为大肠埃希氏菌,其对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药性的主要原因是超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)的产生。中国细菌耐药监测研究2015-2016革兰氏阴性菌监测报告显示,临床分离大肠埃希氏菌中的ESBLs检出率为59.4%。细菌耐药性的增强,会导致感染者住院时间延长、医疗费用增加等,给患者造成极大的负担。有研究指出,抗菌药物在动物养殖领域大规模应用导致细菌耐药性增加,也加速了耐药菌株在动物与人群中的传播。在山东省,非养殖地区农村居民中该菌检出率为42%;某生猪养殖县农村居民中检出率则高达82.5%。研究目的1.了解山东省养殖地区农村居民产ESBLs大肠埃希氏菌的药物敏感性情况和β-内酰胺酶耐药基因特点;2.描述山东省养殖地区农村居民产ESBLs大肠埃希氏菌的分子分型特点,分析耐药菌可能的传播途径,为该地区抗菌药物的使用和耐药菌的预防与控制提供理论依据。研究方法1.菌株来源:本研究基于国家自然科学基金项目“动物与人类细菌耐药性相互影响、传播与干预研究”,在山东省某生猪养殖县12个村庄的居民粪便中分离到的产ESBLs大肠埃希氏菌611株中,随机选取8个村,每村随机选取30株,共240株,并收集相关流行病学资料(包括年龄、性别、家里是否养猪)。2.药物敏感性试验:根据CLSI M100-S27标准,对14种人常用抗菌药物和1种动物专用药使用琼脂稀释法进行抗菌药物敏感性检测。抗菌药物折点值均参照CLSI标准M100-S27,由于CLSI未给出替加环素标准,其折点值参照欧盟药敏试验标准EUCAST2017。3.β-内酰胺酶耐药基因检测:使用普通PCR法检测blaCTX-M、blaSHV和blaTEM三种基因型,blaCTX-M型菌株进一步检测是否为CTX-M-1组和CTX-M-9组。4.分子分型:使用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取核酸,参考MLST网站对目标菌进行分子分型实验,对大肠埃希氏菌7个管家基因进行PCR扩增、测序,应用Contig软件和CLCsequence软件拼接剪切,得到目标长度序列,上传至PubMLST国际统一数据库获得菌株ST序列型,应用eBURSTv3.0软件进行聚类分析。5.全基因组测序:在相对优势ST型ST10的菌株中,选择多重耐药程度最高的菌株进行全基因组测序分析,即耐5、6类药物的全部12株菌株,同时在非多重耐药菌中随机选择3株菌进行对比,共纳入15株ST10型产ESBL大肠埃希氏菌。提取DNA并进行PCR扩增,对PCR产物进行全基因组测序,在PATRIC网站拼接菌株序列,将拼接好的序列上传至Center for Genomic Epidemiology网站进行耐药基因和毒力基因的分析;应用CLC Genomics Workbench软件进行最短距离法聚类分析。主要结果1.一般情况240株产ESBLs大肠埃希氏菌来自8个村240个居民,每个村30人。其中,男性占55.0%(132/240),女性占45.0%(108/240);年龄范围在18-94岁之间;养猪居民占37.5%(90/240),不养猪居民占62.5%(150/240)。2.产ESBLs大肠埃希氏菌的药物敏感性(1)产ESBLs大肠埃希氏菌对多种抗菌药物产生耐药性,对头孢噻肟、氟苯尼考、四环素、复方新诺明的耐药率较高,分别为100.0%(240/240)、90.8%(218/240)、80.4%(193/240)、79.6%(191/240);对亚胺培南、美罗培南、替加环素、头孢西丁、头孢他啶、阿米卡星的耐药率较低,均低于5%。(2)产ESBLs大肠埃希氏菌多重耐药率为84.2%(202/240)。耐药谱中耐3-5类药物的菌株占76.7%(184/240);耐6类药物的菌株占7.5%(18/240)。3.β-内酰胺酶耐药基因检测CTX-M基因检出阳性率为98.8%(237/240),TEM基因检出阳性率为40.4%(97/240),SHV基因检出阳性率为1.7%(4/240)。其中CTX-M基因以CTX-M-9组、CTX-M-1 组亚型为主,分别占22.9%(55/240)、18.8%(45/240)。4.分子分型240株产ESBLs大肠埃希氏菌中,共检出108个ST型。其中,以ST10最多,共32株,占 13.3%;其次分别为ST38(9/240)、ST648(8/240)、ST206(7/240)、ST48(7/240)、ST46(6/240)、ST6338(6/240)、ST744(6/240)、ST162(5/240)、ST349(5/240)。其它ST型分别有5株以下与其对应。eBURSTv3.0软件聚类分析结果显示,部分试验菌株形成14个克隆群。其中,CC10为本研究最主要的克隆群,包括ST10、ST48、ST167等32个ST型,占36.7%(88/240)。5.全基因组测序在15株ST10型产ESBL大肠埃希氏菌中,β-内酰胺酶类、四环素类耐药基因检出率为100.0%(15/15),氨基糖苷类、甲氧苄氨嘧啶类耐药基因检出率为80.0%(12/15),磺胺类耐药基因检出率为73.3%(11/15),大环内酯-林可酰胺-链阳菌素类耐药基因检出率为60.0%(11/15),氯霉素类耐药基因检出率为53.3%(8/15),其它类型耐药基因检出率均在50.0%以下。毒力基因包括gad、iss、cma、iroN、capU等,其中gad基因检出率为100.0%(15/15),iss基因检出率为60.0%(9/15),其它毒力基因检出率均在20.0%以下。聚类分析显示,15株ST10型产ESBL大肠埃希氏菌被聚为两类,其中E004与A012、G055与A022、E042与A025三组菌株与其他菌株相比,亲缘关系相对较近,每组菌株均分别来自不同村庄的居民。结论1.该养殖地区农村居民产ESBLs大肠埃希氏菌中头孢噻肟、氟苯尼考、四环素、复方新诺明的耐药情况较严重,应加强对这四类抗菌药物的应用管理;2.该养殖地区农村居民产ESBLs大肠埃希氏菌中β-内酰胺酶耐药基因以CTX-M为主,主要亚型是CTX-M-9组、CTX-M-1组;3.该养殖地区农村居民所携带的产ESBLs大肠埃希氏菌分子分型存在以CC10为主的小范围聚集性,可能存在动物与人类之间的传播模式。