第一部分 基于RNA高通量测序筛选强直性脊柱炎的差异表达基因研究背景强直性脊柱炎是一种慢性自身免疫性疾病,以反复发作的炎症及进行性的骨化为特征,主要累及中轴骨关节和软组织附着点,具备高度遗传性,疾病由多因素诱发,但病因及发病机制尚未研究清楚。已经发现的与强直性脊柱炎密切相关的基因包括人类白细胞抗原B27(HLA-B27)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、人类白细胞抗原B60(HLA-B60)等,这些致病基因是强制性脊柱炎发病的遗传因素。RNA测序(RNA-Seq)更加全面、精确、经济及可行,RNA测序是第二代测序技术,成本低、精度高、测序快。RNA测序能够鉴别差异表达基因(DEGs)并精确定量外显子及其亚型。既往的研究已经用RNA测序来识别疾病的相关基因,但尚没有对强直性脊柱炎进行RNA测序的报道。通过RNA测序,可以筛选AS患者外周血差异表达基因,并构建功能注释、蛋白质互作网络及转录调控网络。研究目的筛选强直性脊柱炎患者的差异表达基因,并构建功能注释、蛋白质互作网络及转录调控网络,发现一些有意义的致病基因,并探索其生物学功能。研究方法1.血标本总RNA提取:匀浆处理、氯仿萃取、RNA纯化。2.RNA质检。3.RNA-Seq文库制备。4.转录测序。5.差异表达基因的识别。6.功能诠释:GO分析、KEGG信号通路分析。7.PPI网络构建。8.特异性转录调控网络构建。研究结果1.筛选出的503个基因,338个上调、165个下调。2.根据GO富集分析,对其它生物体的反应、炎症反应、血小板α颗粒、细胞活化和细胞因子的产生是差异表达基因中前5位最显著的富集部分。根据KEGG富集分析,我们发现造血干细胞系、吞噬体、麻疹、细胞因子受体相互关联、p53信号通路在GO富集分析中排前5位。FcγRIIB、FHL2、STAT2及SOCS3与破骨细胞分化相关,IFIT1、IFIT3及RSAD2与干扰素相关。3.PPI 网络包括 92 个点和 76 个边,ISG15、HSPB1、MAPILC3A、IFIT1、IFIT3及SOCS3为基线蛋白。4.共鉴定出49种转录因子,前10位的上调及下调差异表达基因构成强直性脊柱炎特异性转录调控网络,包括69个节点及127个边,OCT1、Pax4、HNF4、NKX2-5、RUNX1及HNF是前6位的调控因子。结论1.破骨细胞分化信号通路、干扰素信号通路及其相关基因可能与强直性脊柱炎的发病相关。2.FcyRIlB、FHL2、STAT2及SOCS3是筛选出的与破骨细胞分化相关的差异表达基因,IFIT1、IFIT3及RSAD2是筛选出的与干扰素相关的差异表达基因,其中SOCS3、IFIT1及IFIT3是PPI网络的基线蛋白。3.RUNX1及OCT1是强直性脊柱炎重要的转录因子,分别参与破骨细胞分化信号通路及干扰素信号通路,它们对应的基因也是筛选出的差异表达基因。第二部分 差异表达基因的验证及RUNX1作为致病相关基因的可靠性分析研究背景基因表达包括转录及翻译过程。转录水平对mRNA的检测包括Northem杂交(Northern blot)、核糖核酸酶保护分析(RPA)及反转录PCR(RT-PCR)等,每一种技术都各有其优缺点。翻译水平对蛋白质的检测包括生化反应、免疫学及生物活性检测等。蛋白水平的检测为直接验证,mRNA的检测为间接验证,mRNA有时并非与蛋白水平一致。RT-PCR技术Higuchi等在1992年提出,可对目标基因进行定量分析,早期PCR依靠加入过量的荧光染料并发射荧光信号,通过荧光信号的分析实现mRNA的相对定量,重复性和准确性高,结果可靠。候选基因用于进一步的验证。目的基因的扩增效率、PCR反应试剂、RNA-Seq测序的GC偏好、RNA测序各种参数改变等都会造成PCR验证与RNA-Seq测序结果存在差异,需排除对比关系颠倒、目的基因表达量低、测序样本与验证样本不一致等情况。研究目的扩大样本量,对筛选出的强直性脊柱炎差异表达基因mRNA的表达进行验证,并做出可靠性评价(包括ROC曲线下面积、灵敏度及特异性),找出敏感性及特异性高的备选基因进行下一步的研究。研究方法1.引物设计:NCBI数据库Primer BLAST工具设计FcyRllB、FHL2、STAT2、SOCS3、IFIT1、IFIT3、RSAD2、RUNX1、OCT1 及内参 GAPDH 9个基因的引物。2.提取血液样本总RNA。3.逆转录合成cDNA。4.SYBR GreenPCR扩增仪进行扩增。5.琼脂糖凝胶电泳,溶解曲线分析。研究结果1.AS组与正常对照组相比较,FcγRIIB、RSAD2及OCT1差异无统计学意义,FHL2差异有统计学意义但调控方向矛盾(与RNA-Seq测序结果对比),STAT2差异无统计学意义且调控方向矛盾(与RNA-Seq测序结果对比),它们不是强制性脊柱炎可靠的差异表达基因,RUNX1、IFIT1、IFIT3、SOCS3 4个mRNAAS组与正常对照组相比较,P<0.05,差异有统计学差异,其中,RUNX1负向调控,IFIT1及IFIT3及SOCS3正向调控,与RNA-Seq测序结果一致。2.4个基因的mRNA绘制ROC曲线,RUNX1 ROC曲线下面积0.935、敏感度85%、特异度90%,IFIT1 ROC曲线下面积0.654、敏感度75%、特异度60%,IFIT3 ROC 曲线下面积 0.736、敏感度 60%、特异度 75%,SOCS3 ROC曲线下面积0.703、敏感度55%、特异度85%。RUNX1曲线下面积最大,可靠性较高。结论1.AS组与正常对照组相比较,筛选出的差异表达基因RUNX1、IFIT1、IFIT3、SOCS3有显著性差异,调控方向与RNA-Seq测序结果一致。2.RUNX1的可靠性最高,可能是强直性脊柱炎的致病相关基因。第三部分 RUNX1单核苷酸多态性与强直性脊柱炎患病的相关性分析研究背景B27、TNF-α及IL-1是强直性脊柱炎的致病相关基因,而且是关键基因。B27包括B2705、B2704等亚型,欧洲及北美白种人AS患者以B2705为主,亚洲黄种人AS患者以2704为主,TNF-α的-308位点、-238位点及-850位点被证实与AS相关,IL-1的30735C及31017G两个多态性位点均位于外显子6上、是致病的多态性位点。强直性脊柱炎研究较多的弱势致病基因包括ERAP1、IL-23、OPG、RANKL、FcRL3 及 FCGR2A 等,单核苷酸多态性是确认这些基因与强直性脊柱炎相关的方法。RUNX1位于染色体21q22.12位置,全长260kbp,含有2个启动子并参与转录。RUNX1蛋白由12个外显子编码,这些外显子包括两个定义结构域,RUNT同源结构域(RHD)和转激活结构域(TAD)。RUNX1含有RUNT同源结构域,跨越外显子3-5,用于结合核心结合因子CBF及其它DNA,RUNX1与核心结合因子β(CBFβ)结合构成异源二聚,RUNX基因被称为a亚基,CBF被称为β亚基。SNP关联研究表明RUNX1与自身免疫性疾病发病相关。RUNX1-PDCD1轴与系统性红斑狼疮发病相关;SLC22A4在血液和免疫组织的表达具有特异性,RUNX1的多态性位点影响SLC22A4的转录效率,SLC22A4与RUNX1结合位点内的SNPs,可增加RUNX1的结合而抑制SLC22A4的表达,与类风湿性关节炎的相关;SLC9A3R1的SNPs可破坏与RUNX1的结合位点,RUNX1表达的减少,从而降低SLC9A3R1的转录活性,由于SLC9A3R1-RUNX1结合的丢失导致T细胞的活化,RUNX1对SLC9A3R1或NAT9的调节作用可能是银屑病的易感因素。既往的研究主要集中在与RUNX1有结合位点的交互作用基因,强制性脊柱炎与RUNX1基因多态性的关联未见报道、机制尚不清楚。研究目的对RUNX1基因进行直接测序筛选单核苷酸多态性位点,重点进行外显子及启动子区域的检测,探讨多态性位点在健康人群及强直性脊柱炎患者中的分布,检测rs2071029多态性位点的基因分型,确定等位基因及基因型频率,研究rs2071029位点与强直性脊柱炎的关系。研究方法1.RUNX1基因多态性位点的筛选:分段设计引物,提取外周血DNA,PCR扩增,全序列测序,对样本进行对比分析并筛选出单核苷酸多态性位点。2.多态性位点在AS组及正常对照组中的分布:统计分析筛选出的7个多态性位点的基因型及等位基因频率,筛选出有统计学意义的位点。3.rs2071029位点的基因型及等位基因频率:设计rs2071029位点的引物,提取外周血DNA,PCR扩增,限制性内切酶酶切,琼脂糖电泳后测序,分析基因型、等位基因频率。研究结果1.DNA测序及对比分析发现11个单核苷酸位点,2个在两端调控区,9个在非编码区,7个位点可以在NCBI数据库中检索到。位点-847在5’调控区,即启动子区,位点+69741、+205351、+233586、+191995、+57470、+64280 在非编码区,其中位点+57470、+64280及+69741位于外显子5的侧翼、是RUNT结构域的位点、有生物学意义,位点+191995、+205351及+233586靠近基因的C端,生物学意义较低。2.强直性脊柱炎患者rs2071029位点AA、AG和GG基因型分布分别为9.28%、34.02%及53.61%,A及G等位基因频率分别为27%及73%,正常对照人群rs2071029位点AA、AG和GG基因型分布分别为5.00%、21.25%及73.75%,A及G等位基因频率分别为16%及84%,卡方检验结果表明AS组及正常对照组基因型的观察值与预期值之间无显著差异(卡方值分别为1.58及2.22,0.1<p<0.2),符合H-W-遗传平衡定律,AS组与正常对照组相比,基因型卡方值6.400,P<0.05,差异有统计学意义,等位基因频率卡方值6.700,P<0.05,差异有统计学意义。结论1.采用小样本对强直性脊柱炎患者及正常对照人群进行测序,筛选出候选的单核苷酸多态性位点,初步证实山东济宁地区汉族人群强直性脊柱炎与RUNX1基因rs2071029多态性位点相关,rs2071029多态性位点位于RUNX1基因的启动子上。2.rs2071029位点基因型和等位基因频率分布特征进一步证实RUNX1是强直性脊柱炎的致病相关基因。3.RUNX1属于弱势基因,RUNX1的基因多态性与强直性脊柱炎的发病相关,RUNX1可作为靶点用于强直性脊柱炎的诊断及治疗。第四部分 RUNX1参与破骨细胞分化信号通路的可能机制分析研究背景强直性脊柱炎患者骨量减少及骨质疏松的发生率达50-92%,可引发后凸畸形、腰背部疼痛并严重影响生活质量。但其机制尚未完全阐明,可能与炎症反应、RANKL信号通路及调亡相关因子的调节有关。CD11b、抗酒石酸磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(CATK)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)是破骨细胞的基因型标记物。许多基因及转录因子参与调控破骨细胞分化:第一类基因与巨噬细胞及破骨细胞前体相关,包括M-CSF及PU.1;第二类基因与骨代谢相关,包括RANKL、RANK、OPG、DC-STAMP、NIK及c—Fos等;第三类基因与破骨细胞的活化相关,包括CLCN7、TCIRG1 及 LTBP3 等。破骨细胞分化包括经典及非经典两条信号通路,M-CSF及RANKL属于经典信号通路,生长因子及炎症因子可替代M-CSF及RANKL构成非经典信号通路,在溶骨性病变中起重要作用。RUNX1是破骨细胞分化的抑制剂。RUNX1基因可进行甲基化、乙酰化及磷酸化修饰。甲基化由甲基转移酶催化,甲基化后可抑制IL-3、溶菌酶、肿瘤抑制因子等,与SIN3A结合并激活下游基因。N端的赖氨酸残基介导乙酰化修饰。甲基化及组蛋白乙酰化是骨代谢的调控因素,但尚无RUNX1的表观遗传学直接参与调控成骨与破骨的相关报道。研究目的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定不同骨密度患者RUNX1、TRAF6及RANKL基因的表达,分析RUNX1与TRAF6及RANKL的相关性,通过免疫共沉淀,寻找RUNX1结合TRAF6的证据,探讨RUNX1参与破骨细胞分化信号通路的可能机制。研究方法1.破骨细胞的分离、培养及鉴定:培养液及6孔培养板培养7天。光镜观察并电镜观察。2.RT-PCR检测RUNX1、TRAF6及RANKL mRNA的相对定量:设计GAPDH、RUNX1、TRAF6 及 RANKL 基因的引物,RNA 提取,cDNA 合成,PCR扩增,琼脂糖电泳、凝胶成像,mRNA的相对表达量进行统计分析。3.免疫共沉淀检测RUNX1结合TRAF6的证据:质粒构建及基因扩增、真核表达载体的构建、抗体准备、细胞转染、免疫沉淀、Western blot检验。4.免疫荧光试验:3%多聚甲醛在PBS中固定、游离醛基化、PBS孵育、一抗孵育、二抗孵育、尼康荧光显微镜免疫荧光分析。研究结果1.光镜下,抗酒石酸染色后细胞核为蓝色,有1-3个细胞核,胞浆为红色。电镜下,形体大10-50um,不规则,有伪足,可见骨吸收陷窝。2.RUNX1在A、B、C三组mRNA的相对表达量分别为0.84±0.15、0.47±0.14 及 0.45±0.11,差异有统计学意义,TRAF6 在 A、B、C 三组 mRNA的相对表达量分别为 0.74±0.24、1.01±0.32 及 1.04±0.25,RANKL 在 A、B、C三组mRNA的相对表达量分别为0.55±0.17、0.47±0.23及0.42±0.23,差异无统计学意义,RUNX1与TRAF6的Pearson相关系数为0.489,P值小于0.05,差异有统计学意义,RUNX1与RANKL的Pearson系数为0.372,P值大于0.05,差异无统计学意义。3.FHL2和TRAF6有效地与RUNX1共免疫沉淀,FHL2和RUNX1也与TRAF6共免疫沉淀,RUNX1与FHL2相互作用,抑制TRAF6的功能,三者可能形成复合体参与破骨细胞的形成及分化。4.免疫荧光试验显示RUNX1主要存在于胞核、TRAF6主要存在于胞质、FHL2在胞核及胞质中均存在,三者的荧光照片可以很好融合,三者在破骨细胞中关系密切。结论1.RUNX1表达减少、破骨细胞分化增强,强直性脊柱炎患者骨破坏加重。2.RUNX1在强直性脊柱炎破骨细胞分化过程中与TRAF6相关、与RANKL无直接相关。3.RUNX1、FHL2及TRAF6可能结合成免疫复合物,参与破骨细胞分化。