马铃薯是一种重要的全球性经济作物,马铃薯病毒是引起马铃薯退化的重要原因。马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus, PLRV)是严重危害我国马铃薯产量的三种主要病毒,在田问病毒病多混合发生,给马铃薯生产带来巨大损失。获得同时对三种病毒具有抗性的马铃薯植株显得尤为重要。RNAi是一种基因沉默现象,大量研究表明,将病毒基因片段以反向重复的方式导入植物,其转录会形成具有双链结构的发夹RNA (hairpin RNA, hpRNA),可有效地引发RNA干涉,能对入侵的病毒RNA进行降解,使入侵的病毒不能在植物中积累,从而赋予转基因植物病毒抗性。为了培育同时抗三种病毒的马铃薯品种,本研究基于RNAi原理设计并构建了分别用于抗马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒基因工程的三个单价RNAi载体,和用于同时抗三种病毒基因工程的三价RNAi载体。并利用农杆菌渗入法(Agroinfiltration)介导的瞬时表达分析了所构建载体的干涉效果,具体结果如下：首先通过TC-RT-PCR技术克隆了贵州省几个地区的PVX、PVY、PLRV外壳蛋白(Coat Protein CP)基因。测序后与GenBank上已报道的序列比对,选择保守区设计含attB位点的特异性引物,扩增出三种病毒CP基因3’端约300bp的基因片段。建立的用于克隆马铃薯病毒相关基因的TC-RT-PCR技术简单、快速,灵敏度可靠。将三种病毒的CP基因片段利用Overlap-PCR进行拼接融合,再通过Gateway Cloning System构建含有intron的可用于同时沉默三种病毒CP基因的RNAi载体pHellsgate12-YRX。同时将三种病毒CP基因片段分别通过Gateway Cloning System构建含有intron的RNAi载体pHellsgate12-X302、pHellsgatel 2-Y300、pHellsgate12-R327。Overlap-PCR无需酶切连接在体外通过PCR即可将多个基因片段拼接融合,省时省力。利用Gateway技术构建RNAi载体避免了复杂的酶切连接且不受酶切位点的限制,方便高效。采用农杆菌渗入法介导的瞬时表达分析所构建的几个载体的干涉效果,将pHellsgatel2-X302、pHellsgatel2-Y300转化农杆菌EHAl05后,分别浸润15株6周龄的本氏烟,摩擦接种后,DAS-ELISA检测,浸润pHellsgatel2-X302的无一株发病,浸润pHellsgate12-Y300的仅一株发病,对照全部发病。45株浸润含pHellsgate12-YRX载体EHA105农杆菌的6周龄本氏烟,其中15株摩擦接种PVX,有一株发病,15株摩擦接种PVY,无一株发病,15株同时摩擦接种PVX和PVY,有两株表现花叶症状。可以初步证明所构建载体的干涉效果。农杆菌渗入法介导的瞬时表达周期短,表达水平高,且不受转基因植株常遇到的位置效应的影响,为快速预测RNAi载体用于抗病毒基因工程的效果提供了依据,减少了转基因的盲目性。本研究首次将TC-RT-PCR、Overlap-PCR和Gateway Cloning System技术结合,构建了用于同时抗多种病毒基因工程的RNAi载体。并利用农杆菌渗入法介导的瞬时表达评介载体的干涉效果。创建了一种快速高效的RNAi载体的构建和评测系统,为同时抗多种病毒基因工程的研究打下了基础。