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背景和目的尽管已有研究报道“多次打击”参与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发生和进展,但NAFLD进展至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的相关机制目前尚未完全清楚。近年来,越来越多研究将肠道微生物和肠道屏障完整性与NAFLD联系起来。临床资料显示,肠道炎症常与肝脏损伤有关,如炎症性肠病(IBD)常伴有NAFLD。肠道菌群失调可引起肠道炎症和肠道屏障损伤,随后肠道细菌及其产物和有毒物质及炎症介质的易位可促进肝脏损伤,故肠道屏障功能障碍在NAFLD的发生发展过程中起关键作用。因此,在NAFLD/NASH的发展过程中,肠道屏障破坏是肠肝轴的炎症转运和肝脏免疫持续激活的重要机制。众所周知,肠道黏膜屏障起到了阻止肠道微生物侵入的第一道防线作用。最新的研究发现,除了肠道黏膜屏障之外,还存在抵抗肠道微生物的第二道防线-肠血管屏障(GVB)。GVB可以控制外来抗原进入体内,防止肠道细菌易位及其全身播散。而且,研究证实肠道血管屏障(GVB)损伤可能是导致乳糜泻患者肝脏损伤的重要原因。然而,目前还没有临床和实验研究来证实GVB在NAFLD/NASH中功能。本研究通过建立伴有肠道炎症损伤的NAFLD模型,研究肠道炎症对高脂饮食诱导的NAFLD模型肝脏损伤的影响,并明确肠道炎症加重肝脏损伤的机制;同时观察肠道屏障损伤和肠道菌群移位情况,并进一步证明GVB功能障碍及肠肝轴异常在NAFLD进展中的作用。方法1.通过喂食C57BL/6小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)和高脂饮食(HFD)12周,建立肠道炎症损伤的NAFLD模型,随机分为四组:正常饮食组(Con),高脂饮食组(HFD),DSS组和HFD+DSS组。通过疾病活动度评分(DAI)、结肠形态学变化和结肠组织炎症活动指数(HAI)来评估结肠炎症损伤情况,并用RT-PCR方法检测结肠组织炎症因子IL-1和TNF-α的mRNA表达。应用油红O染色观察小鼠肝脏脂肪变性程度,HE染色观察小鼠肝脏组织病理损伤情况,同时Masson染色观察小鼠肝脏纤维化病变情况。RT-PCR方法检测各组小鼠肝组织中的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1的表达情况以及促纤维化因子Collagen 1、ACTA2、TGF-β、PAI-1和TIMP-1的表达情况。Western blot方法检测小鼠肝脏组织中Collagen 1蛋白的表达情况。2.通过终点显色法鲎试剂检测了各组小鼠门静脉内毒素的含量,此外用RT-PCR方法检测各组小鼠肝脏中模式识别受体TLR-4和TLR-9的表达情况。Western blot方法检测各组小鼠结肠黏膜紧密连接相关蛋白ZO-1和Claudin 1的表达情况。为了评估肠道血管屏障通透性,我们将2mg FITC-dextran 70KD(FD70)注射入小鼠结肠袢中,通过荧光显微镜观察肝脏和脾脏中FD70荧光素的分布情况和同时用荧光酶标仪测定血清中FD70荧光素的含量。另外,通过Western blot方法检测肠血管屏障通透性指标质膜囊泡相关蛋白PV–1的表达情况,并用免疫荧光共聚焦方法进一步检测结肠组织PV-1的表达和分布情况。结果1.与对照组相比,DSS组和HFD+DSS组小鼠体重明显降低,DAI评分显著增加,结肠明显缩短,结肠黏膜损伤(隐窝和杯状细胞减少、隐窝扭曲、黏膜下水肿和炎症细胞浸润)及组织病理评分显著增加。此外,PCR检测显示DSS组和HFD+DSS组结肠中促炎症因子IL-1、TNF-α表达显著升高。油红O染色显示HFD组肝脏出现明显的脂滴,而HFD+DSS组肝脏内脂滴沉积更为明显。HE肝脏组织学检测显示,HFD组和HFD+DSS组肝脏结构紊乱,出现大量的脂肪空泡,而且HFD+DSS组肝脏还伴有炎症细胞浸润。与肝脏组织病理结果一致,HFD+DSS组肝脏促炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表达显著增加。Masson染色显示HFD+DSS组肝脏出现少许纤维组织沉积。与HFD组相比,HFD+DSS组肝脏中Collagen I蛋白的表达增加。而且,HFD+DSS组小鼠肝脏促纤维化因子Collagen 1、ACTA2、TGF-β、PAI-1和TIMP-1mRNA的表达也增加,且明显高于HFD组。另外,Spearman相关性分析表明,模型小鼠DAI评分和HAI评分与小鼠肝脏病变严重程度呈显著正相关(r=0.813,P<0.01;r=0.930,P<0.01)。2.通过内毒素鲎试剂检测门静脉血浆内毒素水平,结果显示HFD+DSS组门静脉内毒素水平较HFD组和DSS组具有升高的趋势,但差异没有统计学意义。RT-PCR结果显示,HFD+DSS组肝脏中TLR4和TLR9的表达明显高于其他三组。Western Blot检测显示,DSS组和HFD+DSS组结肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Claudin1的表达较对照组明显减少。肠血管屏障通透性检测结果显示,HFD+DSS组肝脏脾脏内FD70的荧光密度较HFD组和DSS组显著增加,且HFD+DSS组血清中FD70荧光素的含量较对照组也明显增加。Western blot检测显示,相比于正常组和HFD组,DSS组和HFD+DSS组结肠中PV-1蛋白的表达明显升高。免疫荧光共聚焦结果显示,DSS组和HFD+DSS组结肠中PV-1的表达增加,而且HFD+DSS组结肠中PV-1的表达增加较HFD组更明显,这与western blot结果相一致。另外,PV-1(红色荧光标记)与血管内皮细胞CD31(绿色荧光标记)的表达位置有重叠,表明PV-1蛋白定位于肠黏膜微血管内皮细胞。Spearman相关性分析表明,模型小鼠结肠PV-1蛋白水平与小鼠肝脏病变严重程度呈显著正相关(r=0.868,P<0.01)。结论肠道炎症加重高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠肝脏炎症和纤维化损伤,并促进NASH发生。除了受损的肠道黏膜屏障外,肠血管屏障破坏和菌群移位或内毒素血症可能在NASH的发病机制中发挥重要作用。更重要的是,本研究证实了GVB在NASH发病机制中的重要作用,并进一步突出了饮食因素、肠道屏障和肠道微生物在推动NAFLD进展过程中的复杂作用。了解肠道血管屏障可能为肠-肝轴的调节提供新的见解,从而为预防和治疗NASH提供潜在的治疗靶点。