无论是在发达国家还是发展中国家,糖尿病正以迅速发展的势头成为现代社会的流行病,严重危害公众健康。据WHO统计,2000年糖尿病的发病率为2.8%,约有1.71亿患者；到2030年预计将增长到4.4%,患病人数高达3.66亿。糖尿病及其并发症不仅影响了患者生活质量,也对社会医疗保健带来沉重经济负担。目前2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM)尚无根治方法,主要以对症治疗为主,长期药物治疗会使治疗效果降低。盐酸二甲双胍是2型糖尿病治疗的基础用药,二甲双胍的降糖作用主要是增加糖无氧酵解和抑制肝糖异生、降低肝糖输出,近年来大量研究证实,二甲双胍可通过增高糖尿病状态下骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白水平,促进骨骼肌中GLUT4的转位来增加周围组织对胰岛素的敏感性。近年来研究发现,微量元素在胰岛素的生成、作用发挥以及糖尿病人的能量代谢中起着极为重要的作用,微量元素铬、硒、锌对骨骼肌细胞膜上的GLUT4的表达均有影响，锗元素在抗氧化应激等方而与铬、硒、锌很相似,已有文献报道,有机锗(Ge-132)对糖尿病小鼠具有明显的预防血糖升高的作用,然而,国内尚未见其在2型糖尿病治疗方面的相关实验研究,本实验通过观察有机锗(Ge-132)联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病治疗的影响,初步探讨其相关机制。研究目的本实验通过观察联合应用盐酸二甲双胍和有机锗(Ge-132)对2型糖尿病大鼠治疗的影响,为2型糖尿病的预防和治疗提供新的思路和方向。方法一、2型糖尿病大鼠模型的制备本实验利用高糖高脂饮食诱导联合小剂量STZ腹腔注射的方法制备2型糖尿病动物模型,具体方法为：(一)、动物分组及处理大鼠适应性饲养1周后,逐一称重,随机分成2组,实验组40只,空白对照组10只。实验组饲糖尿病大鼠专用饲料；对照组饲喂实验大鼠普通饲料4周后,全部大鼠禁食不禁水12h,测空腹血糖并称重,然后给实验组大鼠—性腹腔注射STZ30rag/(kg.Bw),以空腹血糖值≥7.8mol/L为标准。(二)、糖耐量实验为验证所制备的糖尿病大鼠模型为2型糖尿病模型,进行口服葡萄糖耐量试验：建模成功后,随机选取实验组及空白对照组大鼠各10只,乙醚吸入式麻醉后,眶静脉丛取血,测其空腹血糖(0min),留取1ml血液,3000r/min离心15min后分离血清待测空腹血清胰岛素(0min)后,按2g/kg予以50%葡萄糖溶液灌胃,于糖负荷后30、60、120、180min测定即时血糖,并于每一时点取血1ml,离心分离血清(方法同前),-200C保存,待测血清胰岛素：计算胰岛素曲线下面积；稳态模型法评估胰岛素抵抗,胰岛素抵抗的标准：HOMA-IR与对照组比较差异有统计学意义。二、有机锗联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响(一)实验动物的分组将建模成功的40只SD大鼠随机分为四组：模型对照组、二甲双胍组、有机锗(Ge-132)组、二甲双胍+有机锗(Ge-132)组。动物饲养在清洁级动物房,5只一笼,实验组与空白对照组同样饲喂实验大鼠普通饲料,自由饮食及去离子水；环境温度为25℃±1℃,相对湿度为40%-60%；饲养员昼夜循环为12h/12h(8:00am-8:00pm)。(二)实验处理1、实验组大鼠血糖稳定一周后,空白对照组和模型对照组：0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5ml/kg.d灌胃；二甲双胍组：盐酸二甲双胍CMC-Na混悬液200mg/kg.d灌胃；有机锗(Ge-132)组：Ge-132CMC-Na混悬液20mg/kg.d灌胃；二甲双胍+有机锗(Ge-132)组：盐酸二甲双胍CMC-Na混悬液200mg/kg.d+Ge-132CMC-Na混悬液20mg/kg.d灌胃。每周一、五测体重；周二、六测进食量、饮水量；周日测空腹血糖。各组试验干预均为8周。观察各组空腹血糖差异。三、有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增效作用机制的初步探讨(一)实验动物的分组实验动物的分组同第二部分。(二)实验处理1、实验干预8周后,有机锗(Ge-132)对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响具体的检测方法及条件同第二部分。2、免疫印迹法测量2型糖尿病大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白水平：(1)组织匀浆干预8周后,处死各组大鼠,取适量右侧大腿的比目鱼肌100mg,按1：9稀释成1%的组织匀浆待测。(2)蛋白含量的测定(BCA法蛋白浓度测定)根据样品的数量,按BCA法蛋白浓度测定样品中目的蛋白的含量,测定A562吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度。(3) Western Blotting抽提的蛋白经过蛋白定量后,进行SDS-PAGE电泳,电泳条件为：80V*30min,待Marker完全分开后,转为120V。蛋白转入PVDF膜,将PVDF膜与X射线片一同放入暗合盒内爆光,待显色后即可照相,照片经扫描后应用图像分析软件进行分析。3、免疫组织化学染色(SP法)测量骨骼肌中GLUT4蛋白表达：(1)组织切片制备适量右侧大腿的比目鱼肌用4%多聚甲醛固定固定,20%蔗糖沉降过夜(4℃),OCT包埋后用冰冻切片机恒冷箱切片,制成15μm的骨骼肌切片。(2)免疫组化染色将切片SP显色,苏木素复染、封片。在多媒体彩色病理图像分析系统上,测定阳性染色面积百分比来衡量GLUT4蛋白在骨骼肌组织中的表达水平。四、数据统计与处理应用SPSS20.0统计软件对实验数据进行分析处理,血糖水平在各组间的比较利用重复测量资料的方差分析。两组间差异采用成组设计资料的t检验,组间两两比较采用LSD-t检验和SNK-q检验。实验数据以均数±标准差(χ±s)表示,以P<0.05作为有统计学意义。直接利用Gene tools对Western-blotting结果进行分析。分析结果采用单因素方差分析进行统计处理。实验结果一、2型糖尿病大鼠模型的制备(一)适应性喂养期间大鼠一般情况大鼠精神状态良好,糖尿病鼠专用饲料喂养4周后,实验组与空白对照组相比体重(Body weight, BW)和FPG均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(二)2型糖尿病大鼠模型建立成功建模成功后实验组大鼠身体进行性消瘦,反应迟钝,毛色枯黄,大便稀软。建模成功后实验组与空白对照组相比FPG升高(见图4)、胰岛素分泌高峰延迟,HOMA-IR及AUCi均明显高于空白对照组,具有统计学差异,说明实验组大鼠存在胰岛素抵抗,符合2型糖尿病的发病特点。二、有机锗联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响(一)2型糖尿病大鼠模型干预8周后,各组大鼠的FPG及GSP的变化2型糖尿病大鼠模型干预8周后,测其各组大鼠的FPG,结果如下：与空白对照组相比,实验组大鼠血清中FPG、GSP均高于空白对照组；模型对照组与有机锗(Ge-132)组无明显差异(p>0.05)；二甲双胍组和二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG、GSP均低于模型对照组、有机锗(Ge-132)组,具有统计学差异；二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG、GSP低于二甲双胍组,有统计学差异(p<0.05),,说明有机锗与二甲双胍联合治疗2型糖尿病大鼠的效果优于单用二甲双胍的治疗效果,但是单用有机锗不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。(二)调整干预措施后,二甲双胍组和二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG的变化在二甲双胍组的胃饲液中加入有机锗(Ge-132) cmc-Na混悬液20mg/kg,同时去除二甲双胍+有机锗(Ge-132)中的有机锗(Ge-132)后,分别于干预8周后的末次空腹血糖值做统计分析发现二甲双胍组加入有机锗(Ge-132)后与8周后的末次血糖无统计学差异,而与二甲双胍+有机锗(Ge-132)组有统计学差异,重复试验结果相同。三、有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增敏作用机制的初步探讨(一)各组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达免疫印迹法结果利用单因素方差分析,对各组数据进行比较发现与空白对照组比较,模型对照组大鼠胞膜GLUT4表达明显下降；与模型对照组比较,二甲双胍+有机锗(Ge-132)组、二甲双胍组、有机锗(Ge-132)组均增加：二甲双胍+有机锗(Ge-132)组较二甲双胍组表达增加,差异有统计学意义。(二)、各组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达免疫组化法结果免疫组化染色结果以大鼠骨骼肌胞质中出现棕黄色物质为阳性,结果显示：空白对照组大鼠骨骼肌的阳性面积百分比最大；模型对照组骨骼肌细胞膜上阳性面积百分比明显减少；二甲双胍+有机锗(Ge-132)组阳性面积百分比接近空白对照组；而二甲双胍组或有机锗(Ge-132)组细胞膜上阳性面积百分比仅部分增加。免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致。结论本实验通过高糖高脂饮食诱导联合小剂量腹腔注射STZ成功制备2型糖尿病动物模型,经过观察有机锗(Ge-132)对2型糖尿病大鼠治疗的影响以及骨骼肌中GLUT4蛋白表达免疫印迹法和免疫组化法的检测结果,初步探讨了有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增敏效果的机制。主要结论如下：(一)有机锗联合盐酸二甲双胍对2型糖尿病大鼠血糖水平的影响1、2型糖尿病大鼠模型干预8周后,测其各组大鼠的FPG,结果有机锗(Ge-132)与二甲双胍联合治疗2型糖尿病大鼠的效果优于单用二甲双胍的治疗效果,但是单用有机锗不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。调整干预措施后,二甲双胍组和二甲双胍+有机锗(Ge-132)组FPG的变化,也说明有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增效作用。(二)各组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达结果利用单因素方差分析,对各组数据进行比较发现与空白对照组比较,模型对照组大鼠胞膜GLUT4表达明显下降；与模型对照组比较,二甲双胍+有机锗(Ge-132)组和二甲双胍组的胞膜GLUT4表达增加；二甲双胍+有机锗(Ge-132)组较二甲双胍组增加。免疫组化染色结果显示：空白对照组大鼠骨骼肌的细胞膜上GLUT4广泛分布；模型对照组骨骼肌细胞膜上GLUT4表达明显减少：二甲双胍+有机锗(Ge-132)组GLUT4的表达接近空白对照组；而二甲双胍组或有机锗(Ge-132)组细胞膜上GLUT4表达仅部分增加。免疫组织化学方法所得结果与免疫印迹一致。综上所述,通过对2型糖尿病大鼠的FPG、GSP以及骨骼肌中细胞膜上GLUT4的含量的表达比较,均说明有机锗(Ge-132)与二甲双胍联合治疗2型糖尿病大鼠的效果优于单用二甲双胍的治疗效果,有机锗(Ge-132)对2型糖尿病治疗具有增效作用。这种增效作用可能是有机锗(Ge-132)通过纠正糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜上GLUT4蛋白表达,增强骨骼肌对葡萄糖的摄取来实现的。