背景与目的：口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinoma OSCC)是最常见的头颈部肿瘤之一,化疗仍然是口腔鳞癌尤其是进展期的口腔鳞癌患者的主要治疗措施。顺铂(cDDP)是目前口腔鳞癌患者首选的化疗药物之一。然而,顺铂耐药成为制约其临床应用的主要障碍。TCRP1是我们前期实验中,从舌癌耐药细胞系Tca8113/PYM中克隆出来的一个新基因,初步的功能研究发现在Tca8113/PYM中沉默TCRP1的表达后其顺铂的敏感性明显提高,相反在亲本细胞中上调TCRP1的表达则显著提高其对顺铂的耐药性。因而推测TCRP1可能是一个顺铂耐药相关基因。本研究将基于以上体外实验结果,探讨TCRP1在口腔鳞癌组织中的表达及其与临床顺铂耐药的相关性；TCRP1在体内实验中作用以及TCRP1介导顺铂耐药的机制。为进一步阐明口腔鳞癌耐药机制,开发新的逆转顺铂耐药靶点提供理论依据。方法：(1)从病理标本库中收集具备完整临床资料的口腔鳞癌标本,根据对顺铂化疗的情况分为敏感组和不敏感组。将所筛选出来的标本制成组织芯片,通过免疫组化法检测组织芯片中的TCRP1的表达水平,然后对结果进行半定量积分法分析。统计分析TCRP1的表达与性别、年龄、肿瘤分期、淋巴结转移、化疗效果及预后的关系。(2)无菌条件下收集新鲜口腔鳞癌组织,一部分组织制成单细胞悬液并种植于96孔板中,MTS法检测其对顺铂药物敏感性,另一部分进行固定、石蜡包埋并制成组织芯片,免疫组化检测这些组织中TCRP1的表达,然后对结果进行半定量积分法分析,统计分析体外药敏实验结果与TCRP1表达的相关性。(3)建立TCRP1高表达及沉默表达的口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型,分别隔日腹腔注射等体积的生理盐水、顺铂(3mg/kg)和5-Fu(30mg/kg),然后观测肿瘤生长情况并绘制生长曲线。给药16天后处死动物剥离肿瘤并固定石蜡包埋,制成组织芯片后免疫组化检测TCRP1的表达,TUNEL检测组织芯片细胞凋亡情况,分析TCRP1表达与裸鼠移植瘤的顺铂敏感性的关系。(4)为明确TCRP1在放疗敏感性中的作用。利用前期建立的稳定的TCRP1过／沉默表达的细胞株,通过克隆形成实验、MTT、彗星实验及凋亡检测分析上述细胞株及其对照细胞的放射敏感性。(5)HPLC法检测cDDP在细胞内蓄积浓度变化,分析TCRP1对细胞内顺铂的吸收转运的影响。Western Blotting检测TCRP1过／沉默表达细胞株中Akt信号通路相关分子的表达改变,包括Akt、p-Akt、bcl-2、NF-κB、金属硫蛋白Ⅰ(MT-Ⅰ)。利用免疫共沉淀技术检测可能与TCRP1发生相互作用的蛋白。(6)免疫组化法检测口腔鳞癌及裸鼠移植瘤组织芯片中p-Akt、金属硫蛋白(MT)的表达。结果：(1)舌癌组织芯片免疫组化的结果显示：TCRP1表达主要定位于胞浆及胞核。在42例有完整临床资料的舌癌标本中,有26例TCRP1阴性或弱阳性表达,16例阳性或强阳性表达。TCRP1的表达与各项临床病理参数包括性别、年龄、TNM分期及有无淋巴结转移均无显著相关性。但是TCRP1与临床疗效有明显相关,在TCRP1表达(-)和(+)的患者中,缓解率达84.62%,而(++)和(+++)患者组中缓解率为37.5%。组间差异有显著性(p=0.0301)。经Spearman相关分析显示两者呈正相关(p<0.05)。相关系数R=0.582。(2)MTS法检测肿瘤组织体外药物敏感性,32例舌癌组织中共获得27例有效数据,其中敏感18例,耐药9例,敏感率66.6%,这与临床顺铂敏感率基本一致。通过对TCRP1免疫组化检测,17例阴性(-)或弱阳性(+),10例阳性(++)或强阳性(+++)。TCRP1(-)和(+)组对化疗敏感者达94.2%,TCRP1(++)和(+++)组对化疗敏感者为20.0%,两组相比有显著性差异(p<0.05)。提示TCRP1免疫组化检测结果与体外药敏实验结果有相关性。(3)成功建立裸鼠移植瘤模型；相对于生理盐水处理组,5-Fu组的裸鼠移植瘤在药物作用下均表现明显的生长抑制；cDDP组,TCRP1高表达的细胞组肿瘤生长仍然保持较快的生长速度,反之,TCRP1表达水平低的细胞组则表现较为明显的生长抑制效应,提示TCRP1的表达与裸鼠移植瘤的cDDP敏感性相关。TUNEL法检测结果显示,裸鼠移植瘤组织内凋亡细胞数随TCRP1表达下调而明显增加。(4)放疗后克隆形成实验结果显示：过表达细胞株Tca8113/TCRP1及对照细胞株的2Gy的生存分数(SF2)分别为0.69±0.04和0.35±0.05。Tca8113/PYM/siRNA及对照组的SF2分别为0.43±0.01和0.78±0.07,组间比较差异均有显著性(p<0.05)。彗星实验检测4Gy的放射线照射后DNA损伤情况,放射线照射24小时后,与对照组相比,在TCRP1低表达的细胞株中,可见明显的DNA拖尾现象。尾距明显较高。Komet 5.5 software软件分析图形并统计学分析后显示组间差异有显著性(p<0.05)。Hoechst33258凋亡细胞染色发现4Gy的放射线照射后,TCRP1高表达的细胞株凋亡细胞数目明显少于TCRP1表达下调的细胞株。同时,Western blot检测舌癌细胞内凋亡相关蛋白的表达,结果显示凋亡相关蛋白caspase-3, caspase-8及caspase-9基础表达在TCRP1低表达细胞中明显增高,相反,抗凋亡蛋白Bcl-2则在TCRP1高表达细胞株中表达升高。(5)HPLC法检测结果显示在不同的细胞株中,顺铂蓄积浓度没有明显差异。Western结果发现：Akt, p-Akt, NF-κB,MT-I及抗凋亡蛋白bcl-2,随TCRP1表达下调而下调。进一步的免疫共沉淀证实了TCRP1与Akt存在物理上的相互作用。Western证实TCRP1对MT-Ⅰ可能存在正向调控作用。(6)免疫组化检测口腔鳞癌组织芯片显示：Akt及MT-Ⅰ的表达与TCRP1表达呈正相关。结论：(1)TCRP1能预测口腔鳞癌对顺铂化疗和放疗的敏感性,可能是一个新的化、放疗耐受标志物；(2)TCRP1可能通过增加口腔鳞癌对顺铂诱导的凋亡抗性而介导顺铂耐受；(3)TCRP1介导OSCC对放疗耐受作用可能与增加放射线诱导的DNA损伤修复有关。(4)TCRP1主要定位于胞核和胞浆,TCRP1不改变细胞内顺铂的蓄积浓度,其作用与“药泵”功能无关；(5)Akt信号通路及MT-Ⅰ可能是TCRP1介导顺铂耐药的重要机制之一。