论文部分内容阅读
目的:研究急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia ALL)患儿及对照组儿童的巯嘌呤甲基转移酶(Thiopurine methyltransferase TPMT)活性,探讨我国儿童TPMT活性水平的分布及其变化规律;采用简易快速适用于临床的高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography HPLC)监测患儿硫嘌呤类药物治疗期间外周血红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸(6-Thioguanine nucleotides 6-TGNs)的浓度,探讨TPMT遗传多态性与药物浓度的关系;评估药物浓度与药物疗效及不良反应的相关性。通过检测ALL患儿TPMT基因多态性及体内活性代谢产物的浓度,结合随访观察临床发生的毒副反应,分析该检测对儿童ALL化疗个体化的意义。方法:1、运用HPLC法对100例ALL患儿分别在初诊时及服用硫嘌呤类药物后TPMT活性进行检测,同时测定180例儿童保健门诊体检的健康儿童TPMT活性,TPMT的活性以单位时间内单位质量的血红蛋白经TPMT催化而生成的6-MTG量来表示。2、采用在线Primer3软件设计引物,PCR产物经虾碱酶及外切酶I纯化后在ABI3130仪上样,对30例具有临床事件的患儿TPMT基因进行DNA测序,测序数据用Polyphred软件进行SNP和突变分析。3、根据先前报道的方法,改良一种HPLC来监测外周血红细胞内6-TGNs的浓度,摒弃费时的使用剧毒物质抽提及萃取过程,采用70%高氯酸沉淀蛋白后100℃水解核苷酸的方法,使之更利于临床样本的监测。分别对37例巩固治疗期(CAM)、51例维持治疗期ALL患儿外周血红细胞内的6-TGNs浓度进行测定,分析药物浓度与TPMT活性及毒副反应的相关性。结果:1、汉族儿童TPMT平均活性为(31.72±10.31)umol.L-16-MTG/ gHb.h,经Kolmogorov-Smirnov检验及W检验统计分析呈正态分布(P=0.064)。ALL患儿与正常健康组儿童的TPMT活性分布无统计学差异((31.38±10.20)vs(30.70±9.67),P=0.577);TPMT活性性别间无差异(P=0.45)。2、ALL患儿使用硫嘌呤类药物治疗后,外周血RBC内TPMT活性改变,治疗后的活性高于治疗前((38.20±11.40)vs(31.72±10.31)),差异有统计学意义(P<0.01);治疗前TPMT活性和呈百分比增长的活性间有很大的相关性(r=-0.804;P<0.01)。3、随访100例ALL患儿治疗过程的毒副反应,发生骨髓抑制组与无骨髓抑制组TPMT活性存在明显差异((20.96±7.24)vs(33.67±9.30),P<0.05);发生严重肝毒性组与无肝毒性组TPMT活性相似((30.30±7.37)vs(31.65±10.81),P=0.597)。4、对30例ALL患儿进行TPMT基因DNA测序,发现5个已知的SNP位点和1个新发现的SNP位点。3/5个等位基因突变发生于内含子区,2/5个位于外显子区,分别为同义突变(474T>C)及错义突变(719A>G)。新发现的SNP位点位于第7内含子区(581-87C>T),已提交至GenBank dbSNP,申请其NCBI号;启动子区-100附近区域发现由17-18碱基组成的数目变异的串联重复(Varivable number of tandem repeats,VNTR)多态性现象,重复次数*V3-*V6。5、30例具有临床事件的ALL患儿TPMT基因DNA测序过程中,仅3例发生719A>G(即TPMT*3C)等位基因杂合突变,考虑TPMT*3C可能是中国汉族人中唯一引起TPMT活性下降的等位基因突变。6、启动子区VNTR可能与转录因子结合,但30例汉族儿童VNTR多态性未引起TPMT活性的差异(P=0.186),可能与样本量较少有关,也可能存在种族差异,需进行大样本量研究证实。7、外周血红细胞内6-TGNs浓度测定中,检测到的浓度范围15.7-1575.6 pmoL/8×10~8RBC(中位数259.4;平均数471.9);31例巩固治疗期(CAM)患儿疗程第10-12天pRBC内的6-TGNs的浓度与疗程结束第8天(即服药后第22天)中性粒细胞计数呈负相关(r= -0.867,P=0.00);与粒缺持续时间的长度表现为很好的相关性(r=0.897,P=0.00)。结论:1、汉族儿童TPMT活性呈正态分布,ALL患儿与健康儿童之间活性无显著差异,性别间活性差异无统计学意义。2、ALL患儿接受巯嘌呤治疗后,TPMT活性明显高于初诊时,活性的增长率与初诊时呈负相关。3、TPMT*3C(719A>G)可能是中国汉族人中唯一的引起TPMT活性下降的等位基因突变,启动子区VNTR是否影响TPMT多态性,需要大样本量的研究。4、TPMT表型-基因型测定可预测药物治疗的反应,预防治疗不良事件发生。5、红细胞内6-TGNs浓度与中粒细胞计数呈负相关,与粒细胞缺乏持续时间相关性良好,可作为早期调节药物剂量的指标之一。6、TPMT活性测定、基因分型结合RBC内6-TGNs浓度的测定,可指导个体化治疗。