论文部分内容阅读
传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染鲑科鱼类可引起造血器官坏死,IHNV高致病力毒株对鲑鳟幼鱼的致死率高达90%以上。此病广泛流行于北美、欧洲、亚洲的各国,已成为世界鲑鳟鱼类养殖业的重要疫病之一。宿主的天然免疫应答是抵抗病毒感染的第一道防线,而激活NF-κB信号通路是宿主发挥抗病毒作用的重要机制之一。本研究筛选影响NF-κB信号通路的IHNV相关蛋白,研究其对NF-κB信号通路的调控机制,为探讨IHNV的致病机理提供了科学数据。通过NF-κB荧光素酶报告系统检测IHNV感染细胞后对NF-κB的转录活性的影响和筛选影响NF-κB活性的IHNV的蛋白。结果表明:IHNV感染CHSE-214和EPC细胞均可激活NF-κB的转录活性,L蛋白激活NF-κB的转录活性,NV蛋白抑制NF-κB的转录活性,且L蛋白对NF-κB的激活作用强于NV蛋白对NF-κB的抑制作用。为研究NV蛋白对NF-κB信号通路抑制作用的分子机制,以NV的真核表达质粒转染细胞,检测p65的磷酸化、转定位及IκBα与NF-κB下游炎症细胞因子的表达。结果表明:NV蛋白抑制IκBα的降解及p65的磷酸化和入核,抑制IL-1、IL-8、IL-17、SAA炎症因子的表达;NV基因的第32-35位类核定位信号位点(32EGDL35)对抑制NF-κB起关键作用。通过重叠延伸PCR方法将亲本毒株wt IHNV HLJ-09 NV基因第32-35位氨基酸突变为丙氨酸或者缺失这4位氨基酸,拯救出NV(32EGDL35)位点缺失的重组病毒,通过感染CHSE-214细胞、RT-PCR鉴定、分子标识的鉴定、电镜观察及间接免疫荧光检测鉴定,获得重组病毒rIHNV-NVT32-35和rIHNV-NVβ32-35。重组病毒感染CHSE-214细胞后NF-κB发生核转移,表明NV蛋白抑制p65的核转移,且第32-35位氨基酸起重要作用。重组病毒的生物学特性研究表明:rIHNV-NVQ32-35和rIHNV-NVT32-35在CHSE-214细胞上的复制能力均低于亲本毒株wtIHNVHLJ-09,说明同时突变NV蛋白第32-35位四个氨基酸时会降低病毒的复制能力。对虹鳟稚鱼致病性试验结果显示:wtIHNVHLJ-09、rIHNV-NVQ32-35和rIHNV-NVT32.35.rIHNV-ANV-EGFP感染组分别在感染后第4天、第6天和第10天出现死亡,死亡高峰分别出现在第 6～8 天、第 7～10 天和未出现,wtIHNVHLJ-09、rIHNV-NVQ32-35 和 rIHNV-NVT32-35,rIHNV-ANV-EGFP感染组20天的累积死亡率分别是90%、55%、60%和10%。感染后同一时间虹鳟脏器病理变化可见rIHNV-△NV-EGFP、rIHNV-NVQ32-35、rIHNV-NVT32-35组仅能引起肝脏、心脏组织的病变,损伤程度低于亲本病毒wt IHNV HLJ-09感染组,一定程度上也反映了重组病毒的致病性要明显低于亲本毒株。通过荧光定量PCR方法检测虹鳟稚鱼感染病毒后细胞因子表达和肝、肾组织中的病毒含量,结果表明IHNVNV32EGDL35位点对抑制IFN1、Mx-1和IL-6的表达起着重要作用,与亲本毒wtIHNVHLJ-09相比,感染重组病毒的肝脏和肾脏组织病毒拷贝数均不同程度的降低,可见NV基因全部缺失或第32-35位四个氨基酸联合突变时,其复制能力不同程度的降低,且病毒毒力亦减弱。