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Harp in蛋白启动的过敏性坏死反应(hypersensitive response, HR)和抗病信号通路的类别与其在植物上起始作用部位或作用靶标密切相关,因此筛选、分离和鉴定受体分子将有助于我们更全面理解harpin蛋白结构及其与植物的互作机制。本文根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) Hpalxoo蛋白N端N21多肽能形成卷曲螺旋(coiled-coil, CC)的特征,采用亲和层析(affinity chromatography, AC)方法从烟草中筛选与其结构互作的受体分子,并对受体分子进行鉴定和理化、结构特征分析。将化学合成的HpalXoo-N21多肽偶联到溴化氰活化的高流速4B琼脂糖微球(CNBr Bio-sep4FF)载体上,填充制备AC柱,分别用从烟草(.Nicotiana tabacum L. "Xanthi")叶片提取的质外体蛋白、细胞壁蛋白和细胞质膜蛋白浓缩液上样,平衡后用非特异性洗脱液(0.1 mol/LNaCl,0.2mol/LNaHCO3,pH9.0)洗脱,仅从质外体蛋白样液获得一条单一的分子量约20 kDa的SDS-PAGE条带。经胶内酶解、MALDI-TOF/MS-MS检测Mascot搜索串级质谱数据鉴定为光系统Ⅱ(PSⅡ)放氧复合物PsbP蛋白(也称23 kDa蛋白)用Biogem 平台的在线程序S2Spred (http://www.biogem.org/tool/S2Spred/)对鉴定获得的受体蛋白氨基酸序列进行二级结构预测,发现其多个区域能形成α-螺旋结构,用COILS(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)在线程式进一步预测CC形成的可能性,结果显示35-55位(AR1表示)、97-117位(AR2表示)和156-176位(AR3表示)氨基酸残基域具有形成CC的可能性,其中35-55位的可能性较高,根据CC互作的原理,推测该蛋白的这段区域可能以CC方式与N21多肽进行互作。圆二色(CD)光谱分析表明化学合成的受体多肽AR1、AR2、AR3都含有α-螺旋,含量AR1>AR2>AR3,分析结果与二级结构预测结果基本一致。聚合状态预测(LOGICOIL和SCORER 2.0程式)表明这些多肽受体自身分子间及与N21多肽都能通过CC结构形成二聚体或三聚体。CD谱数据拟合表明,AR1与N21的等摩尔混合液(ARl+N21)的α-螺旋含量最高,达31.2%,其次是AR2+N21和AR3+N21,a-螺旋含量分别为26.6%和25.7%。变温圆二色光谱发现AR1+N21多肽混合液存在两相结构过程,TM为56±2℃。而AR2+N21和AR3+N21多肽混合水溶液变温曲线近似直线,缺乏两相过程,仅AR2+N21存在微弱的去折叠过程。因此变温CD证明了受体分子可与N21多肽互作形成聚体结构,也说明筛选的受体具有较高的可信度。用FAM荧光基团对N21多肽的5’-N端进行标记,注射烟草叶片8h后,激光共聚焦显微镜观察发现标记的N21多肽大部分位于烟草叶绿体上,少量位于细胞质外体周质空间,说明N21多肽受体可能位于叶绿体和细胞质外体。生物信息学分析表明,PsbP蛋白在高等植物、大部分的藻类和一些光合细菌中广泛存在,位于叶绿体上(PSOR T在线程式),且不含有信号肽(SignalP分析软件),表明其不是转运蛋白。