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内皮功能失调在心血管疾病的发病和进展中扮演着重要角色,是动脉粥样硬化以及急性血栓事件的重要始动因素。血管紧张素Ⅱ作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统最主要的效应因子,通过一系列细胞信号通路介导内皮动能失调,进一步导致血管内皮损伤。脂联素是一种已被证实具有胰岛素增敏作用、抗炎作用和抗氧化作用的脂肪细胞来源的细胞因子。越来越多的证据证实其在延缓心血管疾病的进展中扮演着有益的角色。本课题拟探讨脂联素对于血管紧张素Ⅱ损伤的血管内皮细胞的保护作用及其相关机制。目的:1.探讨脂联素是否能改善血管紧张素Ⅱ造成的血管内皮细胞损伤;2.探索脂联素保护血管内皮细胞的可能机制。方法:1.脂联素改善血管紧张素Ⅱ造成的血管内皮细胞损伤:培养人脐静脉内皮细胞,先后以血管紧张素Ⅱ和脂联素对细胞进行干预,按照血管紧张素Ⅱ和脂联素的浓度分为7个组,分别测定各组的活性氧及4-羟壬烯醛水平,探讨脂联素是否能缓解血管紧张素Ⅱ损伤带来的氧化应激压力。采用四甲基偶氮唑蓝比色法、测定各组乳酸脱氢酶水平,探讨脂联素是否能改善细胞活性。分别通过原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口标记法（TUNEL）、4’,6-联脒-2-苯基吲哚染色、测定天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）以及聚ADP核糖聚合酶（PARP）水平,来探讨脂联素是否能控制内皮细胞由血管紧张素Ⅱ引起的细胞凋亡。2.脂联素保护血管内皮细胞的机制:分别下调人脐静脉内皮细胞中脂联素受体1和脂联素受体2的表达:根据GeneBank提供的人脂联素受体1和脂联素受体2的序列,设计合成siRNA,用siRNA转染人脐静脉内皮细胞,通过Western Blot蛋白定量方法检测脂联素受体的表达被抑制。分别将脂联素受体被沉默后的人脐静脉内皮细胞分为5个组,采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组乳酸脱氢酶水平,探讨脂联素通过哪个受体发挥保护内皮细胞的作用。通过Western Blot蛋白定量方法检测凝集素样低密度脂蛋白受体1的表达水平。接着分别下调人脐静脉内皮细胞中APPL1和腺苷酸活化蛋白激酶的表达:根据GeneBank提供的人APPL1和腺苷酸活化蛋白激酶的序列,设计合成siRNA,用siRNA转染人脐静脉内皮细胞,通过Western Blot蛋白定量方法检测脂联素受体的表达被抑制。将APPL1被沉默后的人脐静脉细胞分为5个组,采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组乳酸脱氢酶水平,通过Western Blot蛋白定量方法检测凝集素样低密度脂蛋白受体1（LOX-1）的表达水平,探讨脂联素保护内皮细胞是否与APPL1表达相关。将腺苷酸活化蛋白激酶被沉默后的人脐静脉细胞分为5个组,采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组乳酸脱氢酶水平,通过Western Blot蛋白定量方法检测凝集素样低密度脂蛋白受体1的表达水平,探讨脂联素保护内皮细胞是否与腺苷酸活化蛋白激酶表达相关。按照血管紧张素Ⅱ和脂联素的浓度分为5个组,通过Western Blot蛋白定量方法检测细胞凋亡抑制蛋白1、凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达水平,探讨脂联素保护内皮细胞与细胞凋亡抑制蛋白1、Bcl-2/Bax比率的关系。结果:1.脂联素能显著改善血管紧张素Ⅱ造成的血管内皮细胞损伤a)脂联素缓解血管紧张素Ⅱ损伤带来的氧化应激压力,显著降低人脐静脉内皮细胞内活性氧的水平（5.89×103±5.30×102 vs 2.83×103±2.88×102,p<0.001）;显著降低4-羟壬烯醛水平（1.22×103±1.06×102 vs 5.53×102±55.9,p<0.001）。b)脂联素改善被血管紧张素Ⅱ损伤降低的内皮细胞活性(1.74×10-1±4.40×10-2 vs3.91×10-1±6.00×10-2,p<0.001),显著降低乳酸脱氢酶水平（67.9±9.93%vs 21.3±4.00%,p<0.001）。c)脂联素抑制血管紧张素Ⅱ损伤促进的内皮细胞凋亡,TUNEL法测定凋亡内皮细胞比率明显下降（61.00±8.67%vs 22.00±2.19%,p<0.001）;显著降低Caspase-3水平(2.65×10-1±3.46×10-2 vs 1.11×10-1±1.54×10-2,p<0.001)、PARP水平(5.14×10-1±7.66×10-2 vs 1.47×10-1±2.68×10-2,p<0.001)以及LOX-1水平(3.65×10-1±3.81×10-2 vs 1.23×10-1±1.39×10-2,p<0.01)。2.脂联素通过脂联素受体1—APPL1—腺苷酸活化蛋白激酶—LOX-1信号通路抑制血管紧张素Ⅱ损伤促进的内皮细胞凋亡a)下调内皮细胞中的脂联素受体1促进了内皮细胞凋亡与对照组内皮细胞相比,转染siRNA后脂联素受体1的表达显著减少（2.86±0.40vs 1.07±0.15,p<0.01）。采用RNA干扰法抑制脂联素受体1的表达后,与对照组内皮细胞相比,脂联素干预组乳酸脱氢酶以及LOX-1水平无明显差异。提示脂联素受体1被干涉后可阻断脂联素的抗凋亡作用。b)下调内皮细胞中的脂联素受体2不影响脂联素的抗凋亡效果。与对照组内皮细胞相比,转染siRNA后脂联素受体2的表达显著减少（1.38±0.15vs 0.45±0.09,p<0.01）。采用RNA干扰法抑制脂联素受体2的表达后,与对照组内皮细胞相比,脂联素干预组乳酸脱氢酶水平仍显著降低（66.0±10.10%vs 31.4±6.09%,p<0.001）。提示即使脂联素受体2被干涉也并不影响脂联素的抗凋亡作用。c)下调内皮细胞中的APPL1促进了内皮细胞凋亡与对照组内皮细胞相比,转染siRNA后APPL1的表达显著减少(7.09×10-1±1.21×10-2 vs 1.83×10-1±3.82×10-2,p<0.01)。采用RNA干扰法抑制APPL1的表达后,与对照组内皮细胞相比,脂联素干预组乳酸脱氢酶以及LOX-1水平无明显差异。提示APPL1被干涉后可阻断脂联素的抗凋亡作用。d)下调内皮细胞中的腺苷酸活化蛋白激酶促进了内皮细胞凋亡与对照组内皮细胞相比,转染siRNA后腺苷酸活化蛋白激酶的表达显著减少(7.98×10-1±1.12×10-2 vs 2.06×10-1±6.82×10-2,p<0.01)。采用RNA干扰法抑制腺苷酸活化蛋白激酶的表达后,与对照组内皮细胞相比,脂联素干预组乳酸脱氢酶以及LOX-1水平无明显差异。提示腺苷酸活化蛋白激酶被干涉后可阻断脂联素的抗凋亡作用。e)脂联素通过脂联素受体1—APPL1—腺苷酸活化蛋白激酶—LOX-1信号通路,进一步调节了细胞凋亡抑制蛋白1、凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达水平,从而抑制血管紧张素Ⅱ损伤促进的内皮细胞凋亡。脂联素提高了细胞凋亡抑制蛋白1表达水平(5.93×10-1±1.11×10-1 vs 1.26±1.52×10-1,p<0.01)。脂联素降低了Bax/Bcl2的比值(6.73×10-1±8.20×10-1 vs 2.59×10-1±3.16×10-2,p<0.01)。结论:1.脂联素能缓解血管紧张素Ⅱ损伤带来的氧化应激压力,改善被血管紧张素Ⅱ损伤降低的内皮细胞活性,抑制血管紧张素Ⅱ损伤促进的内皮细胞凋亡,从而显著改善血管紧张素Ⅱ介导的内皮细胞损伤。2.脂联素改善血管紧张素Ⅱ介导的内皮细胞损伤是通过脂联素受体1—APPL1—腺苷酸活化蛋白激酶—LOX-1信号通路,进一步调节了细胞凋亡抑制蛋白1、凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达水平从而实现的。