目的:肺癌是严重危害人类健康和生命的恶性疾病,肺癌的发病率和死亡率都占各类恶性肿瘤之首位。每年有超过100万人被确诊为肺癌。虽然肺癌的死亡率有所下降,但其发生率仍居高不下,所以我们应将预防作为控制肺癌的重心,即“关口前移”。影响肺癌发生发展的因素包括遗传因素和非遗传因素,非遗传因素主要包括环境因素及由环境因素改变引起的基因组表观遗传修饰。染色质的表观遗传修饰主要由基因启动子区CpG岛甲基化修饰、组蛋白甲基化修饰和组蛋白乙酰化修饰等几种形式,染色质的表观遗传异常改变在肺癌的发展过程中具有重要作用,受到越来越多学者和科研人员的重视。青蒿素(Artemisinin,ART)是黄花蒿中的主要活性成分。青蒿素琥脂(Artesunate,ARTS)和双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的两个衍生物。流行病学研究显示ARTS和DHA的摄入量与包括癌症在内的多种慢性疾病发生率呈反比。体内外研究证明,ARTS和DHA可调节与氧化损伤反应、细胞增殖、新生血管生成、细胞凋亡、炎症和转移相关的多条细胞信号转导通路。值得关注的是,ARTS和DHA抑制肿瘤细胞生长,却对正常细胞无杀伤作用,使其可能成为潜在的肿瘤化学预防药物。然而,较少有文献报道ARTS和DHA化学预防肺癌的作用及机制。肿瘤抑癌基因的失活或原癌基因的激活与肿瘤的发生、发展相关联。在许多病例中,基因突变或染色体结构的异常并不是恶性肿瘤的唯一原因。表观遗传的变化是改变基因表达的模式,但不直接引起DNA序列的变化。基于目前研究现状,本课题将在体外细胞模型中探索青蒿素琥酯和双氢青蒿素对肺癌肿瘤抑制因子Axin1甲基化调控及抗肿瘤作用机制,并利用苯并芘诱导A/J小鼠肺癌模型进一步验证ARTS和DHA对肺癌化学预防的机制。方法:1.ARTS和DHA对肺癌细胞活力及Axin1 mRNA表达水平影响采用商业化的肺癌细胞系A549和111299细胞作为体外研究模型,经不同浓度ARTS和DHA(0-64μM)给药3天后,以MTT法检测ARTS和DHA对两种细胞系抗增殖作用并确定ARTS和DHA给药浓度与给药时间。并通过实时定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)检测Axinl mRNA 水平。2.ARTS和DHA对肺癌细胞Axin1基因表观遗传调控研究基于MTT实验确定的给药浓度,利用Western blot和RT-PCR技术,检测ARTS和DHA对肺癌细胞甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶表达水平影响;激光共聚焦显微镜观察Axin1和DNMT1在细胞中的定位和表达情况;Epi QuikTM DNMT1活性检测试剂盒,检测ARTS和DHA对肺癌细胞中甲基转移酶的活性影响;并采用MSP实验和质谱检测验证ARTS和DHA对A549和H1299细胞启动子区CpG岛的去甲基化作用。3.ARTS和DHA对Axin1上游Akt信号通路作用研究通过 RT-PCR 和 Western blot 实验,检测 ARTS 和 DHA 对 A549 和 H1299 细胞Axin1上游Akt信号通路关键基因和蛋白表达水平的影响。4.ARTS和DHA对Axin1下游WWnt,EMT信号通路作用研究首先进行RT-PCR和Western blot实验,考察了 ARTS和DHA对A549和H1299细胞Wnt/β-catenin信号通路关键基因和蛋白表达水平的影响。此外,通过EdU和平板克隆形成实验检测ARTS和DHA对A549和H1299细胞增殖能力的影响。另外,通过细胞划痕实验检查ARTS和DHA对A549和H1299细胞迁移能力的影响。最后,采用流式细胞术检测不同给药组细胞周期分布比例及细胞凋亡情况。5.ARTS和DHA对肺癌动物模型化学预防作用研究采用苯并芘诱发A/J小鼠肺癌模型,经ARTS(60 mg/kg)和DHA(60 mg/kg),每周5次,造模给药30周后,考察ARTS和DHA在肺癌形成和发展过程中的化学预防作用。统计动物体重变化;在体视镜下观察每只小鼠肺部的结节数量,并记录;HE染色检查肺部病理改变;免疫组化法检查肺组织Axin1,DNMT1蛋白的表达;Western blot方法检测Axin1,DNMT1,Akt信号通和Wnt信号通路中关键蛋白的表达水平。6.统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,多组间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05表示具有显著学差异。采用Graph Pad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean 士 SD表示。结果:1.ARTS和DHA显著抑制肺癌细胞活力并上调Axin1 mRNA表达水平经ARTS和DHA给药3天后,根据MTT检测结果,保证80%以上细胞存活,因此确定在A549细胞中ARTS和DHA给药浓度为0,1,2 μM,给药时间3天;在H1299细胞中ARTS和DHA给药浓度为0,0.5,1 μM,给药时间3天。RT-PCR结果显示5-AZA甲基化抑制剂上调A549细胞中Axin1 mRNA表达水平,上调了 104%±3.65%(/P<0.05),而ARTS高剂量给药组则显著上调,其比例分别为179.41%±7.36%(P<0.05);DHA给药组则分别上调了 144.5%±2.46%(P<0.05),255%±21.38%(P<0.001)。在 H1299 细胞中,ARTS高剂量给药组上调143%±26.69%(P<0.001);DHA高剂量给药组则显著上调了 134.24%±39.15%(P<0.001)。Western blot结果显示ARTS给药组中的Axin1蛋白则分别上调比例约169.78%±84.65%(P<0.05),353.39%±177%(P<0.05);DHA 高剂量给药组上调了 149%±2.9%(P<0.05)。在H1299细胞中,ARTS低、高给药组则分别上调 118%±57.73%(P<0.001)和 181%±0.32%(P<0.05);DHA 给药组则分别上调了 130%± 63.3%(P<0.001),158.16%±77.58%(P<0.0.01)。共聚焦显微镜观察Axin1蛋白在细胞中的定位和表达变化,发现与空白组相比,ARTS和DHA给药组的细胞膜上Axin1的荧光强度显著增强,表明ARTS和DHA可促进Axin1蛋白产生并富集于细胞质内。2.ARTS和DHA在表观遗传水平上抑制DNMTs和HDACs表达同时我们考察了甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶的蛋白和基因水平,实验结果显示,ARTS和DHA可抑制两种细胞甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶表达。特别是对DNMT1的抑制效果显著:在A549细胞中ARTS高浓度使DNMT1蛋白的表达下调了 24%±2.44%(P<0.001);DHA低高浓度使DNMT1蛋白的表达分别下调了 53.9%±3.29%(P<0.001),37%±4.02%(P<0.001);在H1299细胞中ARTS和DHA高浓度使DNMT1蛋白的表达分别下调40.27%±4.8%(P<0.001)和 46.11%±7.11%(P<0.001)。共聚焦显微镜观察 DNMT1蛋白在细胞中的定位和表达变化,发现与空白组相比,ARTS和DHA给药组的细胞膜上-DNMT1的荧光强度显著减弱,表明ARTS和DHA可抑制DNMT1蛋白产生并富集于细胞核内。DNMT1活性检测结果显示:阳性给药组对A549和H1299两种细胞中DNMT1活性抑制效果明显,其下降比例分别为53.43%±2.08%(P<().001)和41.77%±0.45%(P<0.001)。ARTS和DHA可抑制两种细胞DNMT1的活性。在A549细胞中ARTS高浓度使DNMT1活性分别下调了 43.61%± 3.33%(/<0.001);DHA中浓度使DNMT1活性下调比例为41.01%±0.31%(P<0.001);在H1299细胞中ARTS和DHA高浓度使DNMT1活性分别下降47.8%± 0.45%(P<0.001)和 41.65%±0..35%(P<0.001)。另外,通过MSP检测实验,结果显示ARTS和DHA 可降低A549和H1299细胞Axin1基因甲基化水平。通过Quantity one软件计算条带光密度值,以甲基化条带密度与非甲基化条带密度做比,计算未甲基化Axin1比率。在A549细胞中ARTS可分别抑制甲基化Axin1约为76.09%±5.84%(P<0.001)和79.84%± 4.74%(P<0.001)。DHA 则分别抑制了 79.90%± 6.23%(P<0.001)和69.45%±6.23%(P<0.001)。在H1299细胞中,相比于对照组ARTS和DHA则分别显著抑制了 Axin1甲基化约为66.57%±5.39%(P<0.01)和43.28%士 2.57%(P<0.001);85.22%±6.16%(P<0.01)和 66.57%± 3.06%(P<0.001)。同时,由北京六合华大基因科技有限公司通过质谱对给药后的A549和H1299细胞的DNA进行检测进一步验证ARTS和DHA的作用效果。结果显示,在A549细胞中低中高浓度ARTS可以显著抑制甲基化Axin1 比率,且高浓度ARTS变化最为显著,呈现浓度依赖性;而DHA的低浓度给药组甲基化Axin1比率降低最为显著。在H1299细胞中,ARTS和DHA的低中高浓度组抑制甲基化Axin1 比率同阳性给药组的甲基化位点个数和程度相似,都较为明显。3.ARTS和DHA抑制Axin1上游Akt信号通路研究结果表明,随着给药浓度的增加,ARTS和DHA显著抑制A549和H1299肺癌细胞中p-Akt,p-GSK3 β和DNMT1的蛋白表达水平,DNMT1蛋白的下调显示了细胞呈现去甲基化状态,这为Axin1基因的转录表达的上调提供依据。同时,在使用SC79(Akt激动剂)后,A549细胞中的p-Akt,p-GSK3 β和DNMT1的蛋白表达与空白对照组相比分别上调了 162%士 14.7%(P<0.001),155.75%±18.36%(P<0.05)和 153%±15.8%(P<0.001);H12999细胞中的p-Akt,p-GSK3 β和DNMT1的蛋白表达,与空白对照组相比分别上调了166%±8.19%(P<0.001),262%±7.1%(P<0.001),117%±5.38(P<0.001)。相对于激动剂组,ARTS和DHA的给药组以及激动剂+ARTS、激动剂+DHA组中的p-Akt,p-GSK3 β和DNMT1蛋白都有明显下调。说明青蒿素衍生物ARTS和DHA可以通过Akt通路来调节Axin1基因的表达。4.ARTS和DHA抑制Axin1下游WWnt,EMT信号通路研究结果表明,随着给药浓度的增加,A549和H1299细胞Axin1下游通路关键基因 β-catenin,Dv12/3,Naked1/2,LRP6,Wnt5a(属于 Wnt/β-catenin信号通路)和N-cadherin,vimentin,slug,snail(属于EMT信号通路)被抑制,且呈剂量依赖性。EdU和平板克隆形成实验结果表明,ARTS和DHA可浓度依赖性抑制A549和H1299细胞的增殖作用。细胞迁移和侵袭实验结果显示,ARTS和DHA可剂量依赖性抑制细胞的迁移和侵袭作用,其中高浓度给药组作用最为显著。流式细胞仪检测ARTS和DHA可使A549和H1299细胞阻滞在G1期,从而诱导细胞凋亡。5.ARTS和DHA体内化学预防肺癌作用及机制在苯并芘诱发A/J小鼠肺癌模型实验中,ARTS和DHA能减少肺癌的发生,其抑瘤率分别为64.12%和81.25%,且各组体重并无显著性差异,说明药物毒性不强,符合中药高效低毒的特性;另外,HE染色实验结果显示ARTS和DHA能降低苯并芘诱发A/J小鼠肺癌模型中的肺结节的产生和肿瘤细胞浸润。免疫组化实验结果显示ARTS和DHA能降低核蛋白DNMT1蛋白在肿瘤细胞中表达,促进Axinl在正常细胞中的表达。Western blot实验结果显示,与模型对照组相比,ARTS和DHA能够显著性抑制DNMT1蛋白的表达38%±5.16%(P<0.05)和95%±7.69%(P<0.05);而使 Axin1 蛋白的表达上调了 425%± 57.14%(P<0.01)倍和 268%±14.4%(P<0.01)。结论:本课题研究了 ARTS和DHA对肺癌化学预防作用,探索其体内外作用机制,发现ARTS和DHA可能通过抑制Akt通路关键蛋白,调控表观遗传DNMTs和HDACs的蛋白表达,从而上调肺癌抑制因子Axin1基因表达水平,随着Axin1基因表达的恢复,Axin1蛋白合成的增加,Wnt信号通路和EMT信号通路被抑制,从而阻止细胞增殖、侵袭和转移。低浓度的ARTS和DHA可使肿瘤细胞阻滞在G1期,进而诱导细胞凋亡,但效果并不显著。因此,本研究可为ARTS和DHA用于肺癌肿瘤化学预防提供一定理论依据。