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【目的】应用免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因与细胞因子编码序列融合的DNA疫苗,体外转染树突细胞,刺激培养外周血淋巴细胞,以确定框架区DNA疫苗能否诱发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的产生,为该疫苗下一步应用于主动免疫或过继性T细胞治疗的临床试验提供实验依据。【方法】鉴定已经构建的人免疫球蛋白重链基因可变区(IgHV)的框架区基因(FR)与粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列融合的家族性DNA疫苗,无内毒素试剂盒方法提取质粒。采集人外周血单个核细胞(PBMC),采用贴壁培养分离,细胞因子GM-CSF、IL-4诱导,细胞因子“鸡尾酒”促成熟的方法培养树突细胞(DC),用流式细胞仪检测DC的表型;基因枪方法将疫苗DNA质粒转染DC,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确认转染质粒的表达。同时将悬浮的PBMC在IL-2等细胞因子诱导下培养,用转染后的DC刺激培养以诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的产生。用流式细胞仪检测培养的淋巴细胞表型,采用合成的MHC五聚体(MHCPentamer)方法检测抗原特异性细胞毒T淋巴细胞,用荧光标记的流式细胞术方法(FATAL)分析培养的T淋巴细胞对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用,并采用基因测序仪方法对所培养的淋巴细胞进行T细胞受体β链可变区(TCRBV)基因扫描分析,观察培养前后T细胞各个克隆的变化情况。【结果】制备供转染用的无内毒素质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0,经酶切、PCR鉴定,测序结果显示包含IgHV1前导肽、FR区以及连接的GM-CSF cDNA序列,FR区序列包含受HLA-A*0201限制性的抗原九肽QLVQSGAEV的编码序列。外周血PBMC经细胞因子诱导可以产生形态典型的DC,显微镜下计数典型形态的DC占85.0%～96.5%,获得DC数量占PBMC的6.9%～11.3%;细胞因子促成熟后,DC表面CD80、CD83、CD86等标志明显增高,显示获得成熟的DC。比较4种方法转染DC的效率,由高到低依次为Nucleofector电转染、基因枪、Lipofectamine 2000和FuGENE 6,但电转染后细胞死亡多,且失去多突触结构而变成圆形,因此选择基因枪方法转染DC,并对基因枪转染DC条件进行了优化。经RT-PCR及ELISA方法检测转染后的DC的GM-CSF水平增高,证明转染的质粒DNA能够在DC中表达。对2例正常人及2例B细胞淋巴瘤患者的PBMC进行细胞培养及转染或抗原肽刺激,FCM分析显示体外培养的淋巴细胞主要以CD8+T淋巴细胞增生为主;Pentamer检测结果显示转染IgHV1-GM-CSF融合疫苗的DC能够诱导抗原特异性CTL产生,最高可达4.36%;相应的抗原9肽也可以诱导CTL的产生,但时相要早于前者。杀伤试验显示转染DNA疫苗DC刺激的T细胞对具有同样IgHV1家族特征的B细胞淋巴瘤细胞具有增强的杀伤作用,2次刺激后的患者的T细胞对肿瘤细胞杀伤率为32.4±4.9%,而抗原9肽诱导的杀伤率为18.1±3.5%。TCRBV基因扫描显示淋巴瘤、白血病患者治疗后T细胞各个TCRβ家族中一些淋巴细胞消失,呈寡克隆分布或完全缺失,仅少数保持多克隆分布,而经过DC及细胞因子的刺激培养后,TCRβ则呈现完整的多克隆分布;经过DNA疫苗刺激的则呈现部分家族个别优势克隆特征,提示抗原诱导的CTL克隆可能存在于其中。【结论】1.采用基因枪方法成功转染由人PBMC诱导培养的原代DC,制备家族性IgHV框架区DNA疫苗免疫的DC。2.家族性IgHV框架区DNA疫苗体外能够诱导抗原特异性CTL细胞,对同IgH家族的B细胞淋巴瘤细胞具有杀伤作用。