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Flt3表达于多能干细胞(multipotential stem cell)、髓系和淋系前体细胞(precursor)，而单核系的发育过程中，Flt3持续表达。Flt3信号参与了造血干细胞的更新和定向分化。Flt3分子是目前公认的与白血病发生发展机理和治疗密切相关的重要靶分子。4-1BBL／4-1BB为共刺激分子TNF／TNFR超家族中的重要成员，4-1BBL分子表达于各种活化的抗原递呈细胞(APC)和活化T细胞等免疫细胞。4-1BBL分子尚表达于某些肿瘤细胞，如白血病细胞，且与白血病细胞的生存和增殖有关。为研究Flt3和4-1BBL逆向信号在单核细胞和单核系白血病细胞中的作用，本研究选择共表达4-1BBL和Flt3的单核细胞与单核系白血病细胞为研究对象，克隆表达了人全长Flt3分子并成功研制了抗人Flt3单克隆抗体，进而探讨了其生物学特性；利用抗人Flt3抗体和抗人4-1BBL抗体，初步探讨了Flt3信号和4-1BBL逆向信号对SHI-1细胞的生物学效应；同时还探讨了4-1BBL逆向信号对单核细胞的作用及可能的机理。 一、Flt3分子的克隆和转基因细胞的构建 1、人Flt3基因的克隆和逆转录病毒表达载体的构建 根据Flt3基因(GeneBank：Z26652)序列，以骨髓cDNA文库为模板，在分段克隆的基础上采用人工延伸等手段获得人Flt3基因，装入PMD18-T-Vector载体，转化感受态DH5α大肠杆菌。重组质粒T-Flt3经测序正确。重组质粒T-Flt3经PCR扩增Flt3全长基因并引入PstI和BamHI酶切位点，装入逆转录表达载体pGEZ-term，转化感受态DH5α大肠杆菌，重组质粒pGEZ-Flt3经测序正确。 2、“一箭双星”法构建Flt3转基因细胞Flt3及4一IBBL分子在单核细胞和单核系来源白血病细胞中的作用及其机理中文摘要 pGEZ一Flt3、辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后，脂质体法转染包装.细胞一293T细胞，获得具有感染能力的重组逆转录病毒。将含有完整Flt3重组逆转录病毒的293T细胞上清混合WEHI细胞上清，在同一培养孔中同时感染L929细胞和BaF细胞，而后利用L929细胞为贴壁非IL一3依赖生长和BaF细胞为悬浮IL一3依赖生长的特点分离培养，并用不同浓度的Zcocine加压筛选获得抗性转基因细胞的基础上，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析，获得稳定表达Flt3分子的L一Flt3和BaF一Flt3转基因细胞。这一转基因策略为悬浮细胞转基因效率低下提供了新的高效率的解决方案。二、鼠抗人厂!t3单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究1、鼠抗人「lt3单克隆抗体的研制 以BaF一Fl t3细胞和L929--Flt3细胞作为免疫原，免疫Balb/C小鼠。采用B淋巴瘤杂交瘤技术，将免疫Bal b/C小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行融合，经HAT筛选，以BaF一Flt3筛选抗原，经多次亚克隆化及反复筛选，在融合的10块96孔板中，最终得到2株持续分泌抗人Flt3单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (10A5和10G6)，快速定性试纸条分析法结果显示:10G6 19类别为工gGI，10A5 19类别为工gM。经体外长期培养和液氮冻存后，复苏的杂交瘤细胞生长良好，稳定分泌抗体。 将杂交瘤细胞注入降植烷(Pristane)预致敏的Balb/c小鼠，诱生腹水，10G6腹水型单抗的效价>1二1000，IOAS腹水型单抗的效价为、1:5000。10G6腹水经ProteinC亲和层析柱分离纯化，10G6单抗的浓度为1.Zmg/m1，按0.2 pg/1扩个细胞进行流式分析时，仍能识别BaF一Flt3细胞。2、鼠抗人Flt3单克隆抗体生物学特性的研究 以BaF一FI t3为竞争靶细胞，采用竞争抑制实验分析1 OG6识别的抗原位点。实验结果表明IOG6与商品化单抗 SFI.340识别完全不同的位点。 选择多个细胞株:8226、8901、ECV、XGI、XGZ、U266、HL60和SHI一1，利用单抗loAS和IOG6与SFI.340单抗，经间接免疫荧光标记分析，检测结果显示:8901、ECV、XGI和XGZ细胞表面均未检测到Flt3分子表达，而8226、U266、HL6O有低水平Flt3表达，SH工一l表面则检测到Flt3高水平表达。单抗10A5和Flt3及4一IBBL分子在单核细胞和单核系来源白血病细胞中的作用及其机理中文摘要10G6与SFI.340识别谱基本一致。三、鼠抗人F lt3分子单克隆抗体和鼠抗人4一1阳L分子单克隆抗体对白血病细胞的作用及可能涉及的机制 近年来的研究表明，Flt3信号和4一IBBL逆向信号均与白血病细胞的增殖、生存和发病机理密切相关。Flt3信号和4一IBBL逆向信号在白血病的发生发展中究竟扮演什么样的角色?同是与白血病细胞生长具有重要作用的Flt3和4一IBBL分子的免疫干预产生的效应是否有所差异，两者是否具有内在联系?这些问题对白血病的机理和免疫千预以及对全面理解肿瘤免疫过程具有重要的理论意义和应用价值。1、可溶性形式的单抗IFI和单抗1 0G6对SHI一1的效应 采用可溶性形式的IFI和10G6作用于SH工二细胞，给予白血病细胞表面4一IBBL和Flt3分子轻度的刺激，在实验组IFI和10G6浓度为SPg/ml、10pg/ml出现明显的增殖效应(p(0，05)，IFI组、IOG6组、IFI联合10G6组细胞增殖无明显差别，但较工gGI组细胞增殖明显，而各组SH工一1细胞生长状态良好，无明显的形态改变。2、包被形式的单抗IFI和单抗10G6对SHI一1的效应 SH工一1细胞分别在包被抗体IFI和10G6作用?