心血管疾病发病率高,严重威胁人类健康。目前,临床上保护心肌的方法主要有:改善心肌灌注液成分、灌注方法、灌注温度、缺血预处理、药物预处理等。很多实验室行之有效的心肌保护方法转化到临床使用时却缺乏疗效。有关临床心肌保护方法的研究多数是在各种健康成年动物的心脏模型上进行的,而临床病例却经常复合多种疾病和情况,“老龄”就是其中一个重要的影响因素。由于老年心肌与成年心肌在形态、结构和功能上的差异,同一种心肌保护措施在成年与老年表现出的效果却不相同。老年心肌对缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)存在着易损伤倾向,目前临床应用的心肌保护技术均被证实是不完善的,因此研究老年心肌保护防治策略有重要的理论意义和实用价值。1986年Murry等首次提出缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC),它是指反复短暂的缺血和再灌注可以提高组织对随后一个较长时间缺血缺氧的耐受性。药物预处理(pharmacology perconditioning,PPC)的方法,是根据IPC机理,通过药物激发或模拟机体内源性物质而呈现减弱I/R损伤的方法。Kerstion等提出吸入麻醉药预处理(anesthetic preconditioning,APC)和IPC一样,早期保护作用于预处理后立即出现1~3h后消失(第一窗),24h后出现第二窗保护作用(延迟时相)并可持续72h。本研究主要涉及预处理后第一窗保护作用。我们选取老年大鼠为对象,利用大鼠心肌I/R模型和成年大鼠心肌细胞模型,研究和比较预处理早期成年和老年大鼠心肌保护机制的不同特点。通过检测Akt/GSK-3β信号通路的活性和线粒体渗透性转换孔道(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)主要组成成分蛋白的相互作用关系,发现老年心肌预处理保护功能障碍与线粒体m PTP主要成分亲环蛋白D(cyclophilin D,Cyp-D)表达的增高有关。并通过线粒体抗氧化处理降低了老年大鼠心肌Cyp-D的表达,改善了老年大鼠预处理心肌保护作用。我们相信该机制是老年大鼠心肌易损性高的重要成因,为临床老年心肌保护提供新思路和潜在治疗靶点,可横向推广到其他相关疾病防治中。第一部分:老年大鼠心肌预处理早期保护功能障碍和转录后调控机制有关。长期氧化应激压力使老年心肌在形态结构、功能和代谢等方面均不同于成年心肌,如逐渐加重的左心室肥厚、慢性心力衰竭、房颤。老年病人心肌在I/R和体外循环时更容易受损伤,适用于年轻心肌保护方法并不能完全适用于老年心肌。目的:调查成年大鼠和老年大鼠预处理后心肌信使RNA(m RNA)表达的变化,验证预处理的转录调控机制。方法:采用大鼠心肌I/R模型,检测心肌梗死面积和氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)含量。通过基因芯片技术检测m RNA表达的变化,并运用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术证实m RNA的变化。结果:老年大鼠APC后第一窗没有心肌保护功能,APC后成年大鼠心肌ROS含量增高,而老年大鼠ROS没有增高。IPC后成年大鼠心肌Atf3、Egr1、IL6和Ccl2等m RNA表达增加,但是IPC后老年大鼠心肌m RNA没有明显改变,且APC对成年和老年大鼠心肌m RNA也无明显改变。结论:老年大鼠吸入麻醉药预处理心肌保护功能障碍和异氟烷未能引出信号ROS的增高有关,参与预处理心肌保护作用涉及到转录后步骤。第二部分:Akt/GSKβ信号通路调控线粒体渗透性转换孔道在老年大鼠预处理早期心肌保护中的作用。线粒体是心肌I/R损伤的重要靶细胞器,m PTP是介导线粒体损伤的关键因素。Akt/GSK-3β信号通路在心肌保护中有重要作用,p GSK-3β通过与ANT的结合抑制m PTP的开放,起到保护线粒体和维持细胞功能稳定的作用。目的:老年大鼠心肌预处理后Akt/GSK-3β信号通路的变化特点;是否能通过调节Akt/GSK-3β信号通路,改善老年大鼠心肌保护作用;Akt/GSK-3β信号通路和m PTP的作用机制。方法:采用电镜比较成年和老年大鼠心肌I/R损伤后线粒体超微结构变化特点,激光共聚焦显微测定m PTP开放时间。免疫印迹检测Akt/GSK-3β信号通路活性和m PTP成分变化。运用免疫共沉淀技术研究GSK-3β和m PTP各构成蛋白之间的结合率变化。结果:成年大鼠在预处理后Akt/GSK-3β信号通路活化,线粒体水肿和肿胀减少,心肌得到保护。而基础状态老年大鼠该通路较成年大鼠活性增高,预处理不能进一步激活该通路。老年大鼠分布于线粒体的p GSK-3β增多,与m PTP主要成分蛋白ANT结合增多,但由于老年大鼠心肌Cyp-D表达增高且易于和ANT结合,故m PTP开放时间较成年大鼠缩短。结论:老年大鼠Akt/GSK-3β信号通路在生理状态已经被激活,预处理不能进一步激活该信号通路;且老年大鼠心肌线粒体Cyp-D表达增高,m PTP开放阈值降低,这些可能与老年心肌预处理功能失调有关。第三部分:线粒体抗氧化通过保护线粒体渗透性转换孔道使老年大鼠获得预处理早期心肌保护作用。抗氧化治疗被广泛应用于临床治疗,但效果并不理想。重要的原因是很多抗氧化剂不能穿透细胞膜到达细胞内发挥抗氧化效应。TEMPOL是一种新型膜通透性的两性电解质,和线粒体膜有高度亲和力,进入线粒体后发挥SOD拟态作用。目的:对老年大鼠进行线粒体抗氧化处理,观测心肌和线粒体功能的改善,并探讨其可以机制。方法:线粒体抗氧化处理采取腹腔注射TEMPOL 125mg/kg/天,采用I/R模型观测心肌梗死面积,并验证预处理心肌保护作用。试剂盒测定GSH/GSSG,SOD活性,线粒体Ca2+摄取率验证老年大鼠心肌易损性的变化。并用激光共聚焦显微镜测定m PTP开放时间的变化。结果:4周线粒体抗氧化后,GSH/GSSG和SOD活性都明显增高,免疫印迹显示Mn SOD表达增高,且Nitrotyosine的蛋白表达量下降。线粒体Ca2+摄取率恢复正常,m PTP开放时间延长,老年大鼠预处理早期心肌保护功能恢复。结论:4周的TEMPOL线粒体抗氧化处理能够降低老年心肌Cyp-D表达,改善m PTP功能,是老年大鼠重新获得预处理的心肌保护作用。