维生素A是整个生命过程中必需的微量营养素,维生素A及其衍生物已被证实与中枢神经系统的发育和功能密切相关,不但在胚胎期中枢神经系统发育中具有重要作用,而且还参与成年期学习记忆功能。孕妇和学龄前儿童是维生素A缺乏的易感人群,尤其是容易被人们忽视的亚临床维生素A缺乏。但是,由于维生素A过量的致畸作用,包括中国在内的大多数国家对孕期维生素A缺乏,尤其是边缘型维生素A缺乏(marginal vitamin A deficiency,MVAD),并未采取补充措施,维生素A补充普遍在出生后进行。早期营养素供给不仅对近期生长发育有重要影响,也被证实与成年后许多疾病的发生相关,神经系统正是这种程序化作用中极易受影响的器官。中枢神经系统的生长发育和营养状况直接影响大脑的生理功能,大脑的生理功能与智力水平和学习能力密切相关,因此生命早期均衡营养是维持大脑的正常发育和功能发挥的重要因素。并且,目前的观点认为幼年期和成年期的精神性疾病与胚胎期和出生早期正常发育过程受到影响有关,如多动症、孤独症和阿尔玆海默病等。生物信息学和临床研究结果都提示,维生素A与老年期认知障碍退行性疾病——阿尔玆海默病的发生密切相关。早期营养素摄入不足对大脑认知功能的长远期影响是一个不容忽视的问题,这些重要的营养素除了蛋白质、脂肪等,还包括矿物质元素(铁、锌、碘、铜、硒),维生素(维生素A、叶酸、维生素C、维生素D、维生素E),及一些长链不饱和脂肪酸。目前已经证实铁和碘等营养素在生命早期的营养状况对大脑学习记忆功能具有长期影响,而且营养干预效果与干预时间窗密切相关。维生素A对胚胎神经发育的影响已有大量报道,最近有研究发现成年期维生素A缺乏能够导致学习记忆功能损伤,正常大鼠补充维生素A可以在一定程度上减轻老年期的学习记忆功能下降。但是,对于临床上常见的早期(孕期和婴幼儿期)维生素营养状况对学习记忆功能的远期持续性影响及其与老年期认知退行性疾病的关系尚未见报道。本课题组前期流行病学调查发现新生儿血清维生素A水平与2岁时动作能区发育有关;动物实验结果提示从孕期开始的边缘型维生素A缺乏(marginal vitamin A deficiency, MVAD)影响仔鼠学习记忆功能,表现为穿梭箱实验能力降低,电刺激诱发海马CA1区长时程增强(long-term potentiation, LTP)降低,孕中期和出生时进行维生素A干预对幼年期学习记忆功能损伤的恢复效果不同。但是,由于维生素A过多对早期神经系统发育具有毒性作用,目前包括中国在内的许多国家和地区对临床上维生素A缺乏病例的补充推荐在出生后进行。因此,探讨早期MVAD对仔鼠学习记忆功能的远期持续性影响及探讨生后维生素A补充的“窗口期”非常必要。维生素A的代谢产物——视黄酸(retinoid acid, RA)及其信号通路对神经系统的发育和功能的维持具有重要作用。RA参与神经细胞的发生、海马突触可塑性等过程。近来的研究显示,维生素A导致的学习记忆障碍可能与RA信号通路受损密切相关,食物中加入全反式视黄酸(all-trans retinoid acid, atRA)可以使成年大鼠维生素A缺乏引起的学习记忆障碍部分恢复,而且atRA摄入还可以改善老年鼠的学习记忆下降。本课题组前期研究也显示,在维生素A缺乏的大鼠海马脑片中加入atRA,可以观察到海马CA1区降低的LTP恢复正常,而且还发现,孕中期和出生时两个时间点补充幼鼠血清视黄醇水平无差异,但海马LTP恢复效果却有明显差别,这些结果都提示MVAD导致幼鼠不可修复性学习记忆障碍可能与RA的作用密切相关。经典的理论认为RA发挥作用需要几个重要的条件:1.从血清摄入足够视黄醇;2.存在视黄醇转化为RA的代谢酶;3.存在RA受体。视黄酸的转运蛋白、代谢酶和受体等分子被检测到在胚胎和成熟脑组织中均有表达,海马周围的脑脊膜是生后脑组织中视黄酸合成酶表达最丰富的部位,而且成年脑组织是视黄酸含量较高的组织器官之一,尤其是海马,其RA含量居全脑首位。因此,本课题将从大鼠海马组织视黄酸代谢和视黄酸受体两个方面来探讨早期维生素A营养影响大鼠学习记忆功能的机制(详见课题立项假设图)。综上所述,本课题构建MVAD孕鼠及雌性幼鼠模型,随机分为7组:(1)正常对照组(Control组):母鼠3只,给予维生素A充足饲料(含视黄醇6500 IU/kg),幼鼠饲料同母鼠,生后8周处死;(2)边缘型维生素A缺乏组(marginal vitamin A deficient group, MVAD组):母鼠3只,给予维生素A部分缺乏饲料(VAD饲料,含视黄醇400 IU/kg),幼鼠饲料同母鼠,生后8周处死;(3)维生素A补充组(vitamin A supplementation group,VAS组):母鼠3只,给予维生素A缺乏组饲料至分娩,出生时连续口服补充适量维生素A(50 IU视黄醇/g.d),补充后1,4,7d监测血清视黄醇水平,同时改饲对照组饲料,7d时可监测到血清维生素A恢复正常.幼鼠饲对照组饲料,生后8周处死。(4)老年正常对照组(OControl组):母鼠3只,给予维生素A充足饲料,幼鼠饲料同母鼠,生后44周处死;(5)老年边缘型维生素A缺乏组(OMVAD组):母鼠3只,给予VAD饲料,幼鼠饲料同母鼠,为防止出现维生素A严重缺乏的临床症状(如死亡、视力下降、眼盲等),分别于生后10周,生后20周和生后30周三个时间点开始连续3天给予维生素A充足饲料,生后44周处死;(6)维生素A补充老年组I (OVAS1组):母鼠3只,给予VAD饲料至分娩,出生时连续7天口服补充适量维生素A(50 IU视黄醇/g.d),同时改饲对照组饲料,生后44周处死。(7)维生素A补充老年组II (OVAS2组):母鼠3只,给予VAD饲料至分娩,生后4周连续7天口服补充适量维生素A(50 IU视黄醇/g.d),同时改饲对照组饲料,生后8周血清视黄醇检测为正常水平,生后44周处死。水迷宫行为学测试早期MVAD及补充对仔鼠学习记忆的远期影响;检测脑蛋白含量,电镜观察组织超微结构,免疫组化检测β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)和淀粉样前蛋白(amyloid protein precursor, APP)在海马组织内表达水平,初步探讨MVAD对老年期重要学习记忆退行性疾病——阿尔玆海默病发生的影响;定量PCR检测生后早期海马发育过程中海马视黄酸代谢酶的表达,高效液相检测血清和海马组织视黄醇、RA水平,探讨生后早期发育过程中海马视黄酸代谢情况和早期维生素A营养缺乏及补充对海马视黄酸代谢的影响;定量PCR、免疫组化和激光共聚焦技术检测生后早期海马发育过程中视黄酸受体的定量定位表达改变,研究视黄酸受体在生后早期海马发育过程中的重要作用(详见技术路线图)。基于课题组前期研究结果,观察了MVAD对海马学习记忆功能的远期影响,进一步从海马视黄酸代谢和视黄酸受体表达模式两个方面探讨了维生素A及其活性代谢产物视黄酸在早期海马发育及功能中的作用。主要结果和结论如下:1.早期边缘型维生素A缺乏对仔鼠海马学习记忆功能的损伤具有远期持续性影响,水迷宫测试发现从胚胎期开始的边缘型维生素A缺乏大鼠在生后8周和生后44周时均出现学习记忆行为明显受损,边缘型维生素A缺乏对学习记忆功能的影响一直持续到老年期。出生时补充组和生后4周补充组,在不同年龄阶段学习记忆功能恢复程度不同,出生时补充组生后8周(成年时)时学习记忆水平与正常组之间存在差异,在生后44周进行测试,可以观察到其空间学习记忆功能恢复正常,这可能与边缘型维生素A缺乏影响胚胎期脑发育,延缓幼年期学习记忆功能的成熟相关。值得注意的是,出生4周才开始补充维生素A的仔鼠学习记忆功能在成年期(前期实验)和老年期均明显降低,提示早期维生素A营养干预对于恢复远期学习记忆功能损伤的作用存在“窗口期”,错过了有效干预时期将导致学习记忆功能损伤难以恢复。2.海马组织超微结构观察持续边缘型维生素A缺乏导致仔鼠海马神经元和神经胶质细胞损伤,神经元脂褐素堆积增多,促进神经系统老化,用大鼠特异性抗体分别对正常和MVAD仔鼠生后44周海马组织切片染色分析,发现两个组海马组织内均未见明显Aβ蛋白表达,但MVAD导致APP蛋白表达增加,有可能是边缘型维生素A缺乏影响APP代谢而造成APP蛋白在海马组织中堆积,这使形成淀粉样蛋白斑的潜在风险增加,提示边缘型维生素A缺乏影响远期海马结构和功能,可能提高老年期学习记忆退行性疾病——阿尔兹海默症患病风险。3.仔鼠外周血和海马视黄醇——视黄酸系统对早期边缘型维生素A缺乏的应答并不一致。在MVAD组,我们观察到由于食物来源的维生素A减少,血清中的视黄醇浓度明显降低,当给予维生素A补充时,血清视黄醇浓度恢复到正常水平,但是,海马中的视黄醇和视黄酸浓度并不随血清中的视黄醇和视黄酸浓度而改变,能够保持在一个稳定的范围。对海马视黄醇和视黄酸的浓度与大鼠行为学测试结果进行相关分析,发现无论是海马视黄醇还是视黄酸,与学习记忆行为的改变都无明显相关性。因此,在维生素A供给和血清视黄醇水平发生改变的状态下,海马组织视黄醇和视黄酸浓度能够稳定一定范围,这可能是海马的自我保护机制;早期边缘型维生素A缺乏及补充对海马RA浓度影响不大,其导致的空间学习记忆损害可能由其他机制引起。4.早期边缘型维生素A缺乏引起分离的海马组织RALDH2表达主动性降低,而RALDH1出现补偿性的表达升高,同时,CYP26A1的表达也出现代偿性降低。在海马视黄醇供给充足的状态下,合成酶只有部分表达降低,分解途径受到抑制,结果正如我们观察到的,海马视黄酸浓度保持稳定,atRA在MVAD组海马组织中还出现了显著升高。实验中还发现维生素A营养干预后RALDH2和CYP26A1都恢复到正常水平,但升高的RALDH1水平并没有改善,此时海马中atRA浓度仍然高于正常。因此,视黄酸合成分解代谢酶表达可能参与海马自身调控,是海马的视黄醇和视黄酸浓度在维生素A不同营养的状态下能够保持稳定的重要机制。5.结果显示生后4周和生后8周海马组织RARαmRNA和蛋白的表达比出生时下降大约30%左右,在生后发育初期有一个下降过程,在断乳期后稳定在一定水平。在海马的齿状回和CA1-CA3区的锥体细胞中,大鼠生后发育后期(生后3周和生后8周)表达RARα蛋白的细胞较生后发育前期(生后1周)均明显减少;而对于颗粒层细胞来说,CA1-CA3区的颗粒层细胞在生后发育后期几乎没有观察到RARα蛋白表达,齿状回颗粒层细胞虽然一直有RARα蛋白,但表达水平也是逐渐降低。海马生后发育过程中的RARαmRNA的表达变化可能更主要的是与神经细胞的修剪和成熟有关,学习记忆环路中重要的齿状回颗粒层细胞和CA1-CA3区锥体细胞层均持续表达RARα蛋白,进一步证实了RARα在成年海马的学习记忆功能中的重要作用。6.本实验发现在生后海马发育成熟的过程中,海马各区RARα受体蛋白表达存在时间有序性的细胞内转位表达现象。随着海马发育成熟,海马细胞,尤其是锥体层细胞内,RARα蛋白表达显现出核内向核外转移的胞内表达转位现象,生后发育早期以胞核表达为主,生后发育晚期以胞浆表达为主,这种海马神经细胞胞浆内定位表达可能参与蛋白翻译作用,与学习记忆功能发育密切相关。7.早期边缘型维生素A缺乏导致出生时和生后8周RARαmRNA表达降低,出生时观察到边缘型维生素A缺乏降低RARα蛋白表达水平,而且出现大量胞浆表达,使RARα胞浆表达时间点提前。提示孕期开始的边缘型维生素A缺乏损伤学习记忆功能发育中重要的视黄酸受体RARα生后发育早期程序性表达模式,可能是错过生后早期发育时间窗导致远期不可修复性学习记忆障碍的机制之一。