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鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis）由鸭甲肝病毒（Duck hepatitisAvirus, DHAV）和鸭星状病毒（Duck astrovirus）引起，主要感染1～3周龄雏鸭，具有高度致死（死亡率90%以上）、传播迅速的特点。其中DHAV型鸭肝炎呈世界范围分布，给养鸭业带来极大的损失。目前，国内外对于DHAV的研究已经从基因检测、克隆测序、进化树分析等过渡到了对其基因组功能的研究，结构与功能蛋白质的表达以及单克隆抗体的制备是此类研究的常用手段。本研究在本实验室已经制备了单克隆抗体4F8并对其所识别的抗原表位进行了初步定位的基础上，对初步定位区段进行了进一步精确定位并鉴定了4F8在DHAV其他血清型的VP1蛋白上的抗原表位，从而为DHAV的诊断、分子流行病学调查、新型表位疫苗的研制提供了科学依据。研究主要包括以下内容：1.抗DHAV-1单克隆抗体4F8中和活性的测定本实验室在前期的研究中用DHAV-1全病毒粒子免疫BLAC/c小鼠后，取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合，最后筛选出了能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4F8。本研究通过对小白鼠腹腔注射4F8杂交瘤细胞的方法制备了抗DHAV-1的单克隆抗体，通过定量病毒稀释单抗的方法测定了单抗4F8对DHAV-1与DHAV-3的中和活性。结果发现，对于100ELD50的DHAV-1，0.1mL的腹水蛋白含量为2.056mg/mL的单抗4F8能保护50%以上鸭胚免于死亡的抗体稀释倍数为5.0，而对于100ELD50的DHAV-3，0.1mL的腹水蛋白含量为2.056mg/mL的单抗4F8能保护50%以上鸭胚免于死亡的抗体稀释倍数为9.8。研究结果表明单抗4F8对DHAV-1和DHAV-3均有一定的中和作用，但中和效价不高。同时，虽然单抗4F8是用DHAV-1免疫后制备的，但其对DHAV-1的中和活性不如对DHAV-3的中和活性高。2.单抗4F8在DHAV-1上识别线性表位的准确定位研究本实验室在前期的研究中确定了4F8识别线性抗原表位且抗原表位为DHAV-1VP1蛋白的第74~82位氨基酸。本研究在此基础上本研究构建了6个DHAV-1VP1分段蛋白的pET-32a（+）重组表达质粒，转化到Rosetta菌株中，用IPTG诱导表达融合蛋白，对表达产物做SDS-PAGE鉴定表达后，再用单克隆抗体4F8分别对其进行Western blot分析。根据Western blot结果结合引物设计推测单抗4F8识别的抗原表位，结果表明，DHAV-1VP1蛋白的75～80位氨基酸为单抗4F8的抗原表位，即75GEIILT80。通过与NCBI上发表的DHAV各血清型病毒序列比对分析发现，该抗原表位在DHAV-1的VP1蛋白上高度保守，而DHAV-2和DHAV-3分离株均在该部分存在变异。3.单抗4F8对DHAV-2VP1蛋白上的抗原表位进行识别的研究DHAV-2为分离自台湾的DHAV新血清型，目前仅在台湾地区分离报道过。根据NCBI上已发表的台湾04G株DHAV-2的基因序列，本研究直接合成了DHAV-2的VP1基因，构建了2个VP1分段蛋白的pET-32a（+）重组表达质粒，转化到Rosetta菌株中，用IPTG诱导表达融合蛋白，对表达产物进行蛋白质凝胶电泳鉴定表达后，用单克隆抗体4F8与表达产物进行Western blot分析。结果表明，DHAV-2的VP1蛋白上不存在4F8可以识别的抗原表位。4.单抗4F8对DHAV-3的VP1蛋白上进行抗原表位识别的研究将DHAV-3与DHAV-1进行病毒序列比对时，发现在75～80位氨基酸二者只有一个氨基酸的变异，针对这个比对结果，本研究构建了4个DHAV-3VP1分段蛋白的pET-32a（+）重组表达质粒，转化到Rosetta菌株中，用IPTG诱导表达融合蛋白，对表达产物进行蛋白质凝胶电泳确定表达后，用单克隆抗体4F8与表达产物进行Western blot分析。结果表明，DHAV-3VP1蛋白上75GEVILT80也是可以被4F8识别的抗原表位。