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背景与目的: 在中国,肝细胞癌是常见的五大肿瘤之一。肿瘤干细胞(CSCs)与肝癌的复发和转移关系密切,也是影响肝癌预后的主要因素。 研究表明肿瘤干细胞标志物CD133存在细胞核内的定位,然而,CD133核转位的机制及其在MYH9调控肝癌干细胞特性(干性)的作用未见报道。 内容与方法: 1.CD133蛋白在肝癌细胞中的定位 (1)Wnt3a处理肝癌细胞,免疫荧光检测肝癌细胞中CD133,CD44的表达及定位; (2)Wnt3a处理肝癌细胞,核浆分离法提取蛋白,Western blot检测CD133在细胞核和细胞浆中的表达量。 2.探索CD133核转位的分子机制 (1)免疫共沉淀(Co-IP)检测CD133与β-catenin的相互作用; (2)Wnt3a促进β-catenin核转位以及在促进β-catenin核转位同时干扰β-catenin表达,免疫荧光检测肝癌细胞中CD133,β-catenin的表达及细胞核定位; (3)Wnt3a促进β-catenin核转位以及在促进β-catenin核转位同时干扰β-catenin表达,核浆分离法提取蛋白,Western blot检测CD133,β-catenin在细胞核和细胞浆中的表达量。 3.探索CD133与Wnt/β-catenin通路的关系 (1)Wnt3a促进β-catenin核转位并干扰CD133表达,体外功能实验检测CD133对肝癌细胞干性的影响; (2)Wnt3a促进β-catenin核转位并干扰CD133表达,Western blot检测CD133对β-catenin,c-Myc,CD44,Slug表达的影响; (3)Wnt3a促进β-catenin核转位并干扰CD133表达,染色质免疫共沉淀(ChIP)证实CD133对Wnt/β-catenin通路活性的影响。 4.探索CD133核转位介导MYH9促进肝癌细胞干性的机制 (1)体外功能实验检测MYH9对肝癌干性的影响; (2)Western blot检测MYH9对Wnt/β-catenin通路活性的影响; (3)免疫荧光检测MYH9对CD133,β-catenin入核的影响;以及MYH9通过β-catenin对CD133入核的影响; (4)核浆分离法提取蛋白,Western blot检测MYH9对CD133,β-catenin入核的影响;以及MYH9通过β-catenin对CD133入核的影响; (5)过表达MYH9促进β-catenin核转位并干扰CD133表达,体外功能实验检测CD133对MYH9促进肝癌细胞干性的影响; (6)过表达MYH9促进β-catenin核转位并干扰CD133表达,Western blot检测CD133对MYH9促进Wnt/β-catenin通路活性的影响; (7)过表达MYH9促进β-catenin核转位并干扰CD133表达,ChIP证实CD133对MYH9促进Wnt/β-catenin通路活性的影响。 5.分析CD133,MYH9在肝癌组织中的表达特性、表达相关性及对预后的影响 (1)生物信息学分析; (2)免疫组化检测CD133,MYH9在肝癌组织与癌旁组织中的表达情况并进行相关性分析; (3)分析CD133对肝癌预后的影响。 结果: 1.在Wnt/β-catenin通路激活时,CD133在肝癌细胞的核内定位增多; 2.CD133能与β-catenin相互作用;在Wnt/β-catenin通路激活时,β-catenin入核增多,从而促进CD133的核转位; 3.CD133核转位进一步激活了Wnt/β-catenin通路,从而促进肝癌细胞的干性; 4.MYH9激活Wnt/β-catenin通路,β-catenin入核增多,从而促进CD133的核转位; 5.CD133核转位介导MYH9通过Wnt/β-catenin通路促进肝癌细胞干性; 6.细胞核内CD133表达与MYH9表达呈正相关;CD133的核转位提示了肝癌患者预后不良。 结论: CD133核转位在肝癌中发挥促癌作用,CD133与β-catenin相互作用而发生核转位,又能促进β-catenin调控的基因转录激活Wnt通路;CD133核转位介导MYH9通过Wnt/β-catenin通路促进肿瘤干性的作用。