哺乳动物卵泡发育和卵母细胞成熟过程由多种细胞因子和调控途径的参与,是一个复杂的调控网络,涉及细胞增殖、凋亡、周期及细胞分化调控,而基因转录过程中转录水平(如micro RNA调控)及翻译后水平调控(如SUMO化修饰)发挥着重要作用。利用本课题组已经获得的小鼠出生后至初情期不同时期及超数排卵过程中的micro RNA深度测序结果,本课题选择了可能参与调控细胞周期检验点激酶1(Chk1,DNA损伤检验点和正常细胞周期调控)、p53(细胞凋亡调控)及类泛素分子SUMO-1(蛋白质翻译后修饰)表达的6种micro RNAs(miR-15a、miR-16、miR-410、miR-485、miR-495和mir-133a),研究了这6种micro RNAs在不同大小卵泡中的表达规律及对卵泡刺激素FSH和黄体生成素LH的反应性;micro RNAs在体外培养腔前卵泡或颗粒细胞中的作用及机制;Chk1/2在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制;检测并验证了调控p53、Chk1及SUMO-1的几种micro RNAs。研究结果如下:1.所选6种microRNAs在卵泡发育过程中的表达规律、作用和调控途径(1)不同直径大小卵泡中6种microRNAs的表达规律。分离并检测了腔前卵泡(100-130μm和200-280μm)和有腔卵泡(排卵前期卵泡450-550μm和围排卵期卵泡500-600μm)中micro RNA的表达规律。Q-PCR结果显示miR-410和miR-495在较大直径的腔前卵泡(200-280μm)内的表达显著性低于其它3个时期卵泡内的表达(P<0.01;P<0.05);miR-485在较大直径腔前卵泡(200-280μm)内的表达低于其它3个时期卵泡内的表达,同时其在有腔卵泡(500-600μm)内的表达显著高于腔前卵泡内的表达(P<0.01);miR-15a和miR-133a在较小腔前卵泡(100-130μm)内表达量最高,随着卵泡直径增加其表达水平显著性降低(P<0.001;P<0.001);miR-16在有腔卵泡内的表达水平显著性的高于腔前卵泡内的表达水平(P<0.01)。(2)FSH和LH对体外培养颗粒细胞中6种micro RNAs表达水平的调控。21日龄雌性小鼠卵巢分离获得的颗粒细胞(3w-GCs)进行体外培养,添加FSH培养6 h后,miR-485、miR-495、miR-15a和miR-133a的表达水平与0 h相比显著性降低(P<0.001),miR-410和miR-16的表达水平显著性升高(P<0.001;P<0.05);21日龄雌性小鼠腹腔注射PMSG 48 h后卵巢分离获得的颗粒细胞(pre-GCs)体外培养过程中添加lh,3h后mir-410、mir-485和mir-133a的表达水平与0h相比显著性升高(p<0.001),mir-15a和mir-16的表达水平显著性降低(p<0.05);lh培养24h后,mir-410、mir-485和mir-133a的表达水平降低。此外,利用microrna模拟物转染颗粒细胞过表达mir-485和mir-495,同时添加fsh培养。q-pcr结果显示fsh也可以显著下调模拟物对mir-485或mir-495的过表达水平(p<0.01;p<0.001)。(3)6种micrornas对腔前卵泡体外生长影响的初步研究。12-14日龄雌鼠卵巢分离得到的100-130μm直径腔前卵泡经过2d的预培养后,分别转染microrna模拟物过表达该种microrna,继续培养4-6d,每隔2d检测卵泡直径。结果显示转染mir-485模拟物过表达后,在前期(培养4d)实验组和对照组卵泡直径和卵泡生长速率没有显著差异,而培养到第6d过表达mir-485组卵泡直径显著低于对照组(p<0.01),其第4-6d卵泡的生长速率也显著低于对照组(p<0.05);转染mir-495模拟物过表达后,培养4d实验组和对照组卵泡直径没有显著差异,然而其第2-4d卵泡生长率显著低于对照组(p<0.05)。这些结果说明mir-485和mir-495可能抑制腔前卵泡的生长,这一结果与较小直径腔前卵泡高表达而较大直径腔前卵泡低表达mir-485和mir-495的结果一致。转染mir-133a、mir-15a和mir-16模拟物过表达后,对卵泡的生长和生长速率均没有显著性影响。但是,过表达该3种micrornas后,其第4-6d卵泡生长率均高于对照组。(4)6种micrornas对体外培养有腔卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。分别利用microrna模拟物或抑制物转染体外培养的排卵前卵泡颗粒细胞,转染48h后检测细胞增殖或凋亡情况。结果显示:过表达mir-485可以促进颗粒细胞增殖(p<0.001),抑制颗粒细胞凋亡(p<0.01);过表达mir-495抑制颗粒细胞的增殖(p<0.01),诱导颗粒细胞凋亡(p<0.01),使细胞周期阻滞在s期(p<0.01);过表达mir-133a可以抑制颗粒细胞的增殖(p<0.01),使细胞周期阻滞在g1期(p<0.01),而降低mir-133a可以促进颗粒细胞的增殖(p<0.001);过表达mir-15a可以促进颗粒细胞的增殖(p<0.001)。这些结果暗示这些micrornas可能通过对颗粒细胞增殖和凋亡的调控参与卵泡生长和闭锁调控。(5)mir-495对体外培养颗粒细胞中雌激素分泌的影响。体外培养的颗粒细胞经microrna模拟物转染48h后检测培养液中雌激素的含量。结果发现:过表达mir-495可以显著降低培养液中雌激素水平(p<0.001),同时,q-pcr检测相关基因表达发现mir-495模拟物可以抑制颗粒细胞中类固醇激素合成相关基因(cyp11a1、cyp19a1和star)mrna表达水平。这一结果暗示mir-495可能通过调控颗粒细胞中类固醇激素合成酶的表达而参与雌激素的合成和分泌,进而影响卵泡的生长和发育。(6)靶基因筛选和验证。利用双荧光素酶报告系统和颗粒细胞体外培养体系,成功筛选并验证了3个micrornas的靶基因。mir-485可以与p533’utr结合,并在转录水平调控p53mrna和蛋白的表达水平;mir-15a和mir-16可以与chk1mrna的3’utr结合,其中mir-16可以同时降低chk1的mrna和蛋白水平表达,推测其可能通过与chk1的3’utr区结合并介导其mrna降解,从而降低其蛋白表达水平,而mir-15a只能降低chk1的蛋白表达而对其mrna表达水平无显著影响,暗示mir-15a可能是通过结合chk1的3’utr后抑制其mrna翻译而调控chk1蛋白表达水平;mir-133a可以与sumo-1基因的3’utr结合,降低sumo-1蛋白表达水平,暗示mir-133a可能通过抑制sumo-1mrna翻译而调控其蛋白表达水平。2.chk1/2在小鼠腔前卵泡发育,颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制研究(1)利用chk1/2特异性抑制剂azd7762抑制chk1/2后阻碍腔前卵泡的体外生长。腔前卵泡体外培养4d,抑制剂培养卵泡同对照组卵泡相比表现不生长或负生长的现象。通过显微镜观察卵泡的形态,发现抑制剂培养卵泡表现为卵泡闭锁。(2)抑制chk1/2后颗粒细胞生长阻滞。不同浓度chk1/2抑制剂azd7762培养颗粒细胞3d,结果发现抑制chk1/2后可以显著性的抑制颗粒细胞的增殖(p<0.001),具有时间和剂量依赖性;细胞周期被阻滞在s和g2期(p<0.001)。chk1/2抑制剂培养2d后可以显著性诱导颗粒细胞的凋亡(p<0.05)。同时,增殖相关基因pcna的mrna和蛋白表达水平被chk1/2抑制剂显著性的下调(p<0.01;p<0.01);凋亡相关基因bax的mrna和蛋白表达水平被chk1/2抑制剂显著性的上调(p<0.001;p<0.05)。(3)抑制chk1/2后可以降低卵母细胞的体外成熟率。卵母细胞体外成熟培养初期添加chk1/2或chk1抑制剂(azd7762和sb218078),结果发现抑制chk1/2或chk1对gvbd率没有显著性的影响,但是却显著性的降低pb1率(p<0.05);通过不同培养时间添加抑制剂AZD7762的方法,发现卵母细胞被阻滞在减数分裂的中期或前中期。(4)抑制Chk1/2破坏卵母细胞体外成熟培养过程中纺锤体的组装和染色体的凝集,改变α-tubulin、γ-tubulin、Securin和CREST的定位,诱导phospho-P38-MAPK表达升高。(5)抑制Chk1/2可以破坏成熟卵母细胞纺锤体形态并抑制卵母细胞激活率。超数排卵获得成熟卵细胞在含Chk1/2抑制剂AZD7762中继续培养1-2 h。发现培养1 h后卵母细胞纺锤体形态正常,而培养2 h卵母细胞中纺锤体结构显示严重异常。成熟卵母细胞在体外激活前添加Chk1/2抑制剂后再激活培养,其第二极体排放率和原核形成率均显著低于对照组(P<0.01;P<0.001)。总之,本论文揭示了6种micro RNAs在大小不同直径腔前卵泡和有腔卵泡中的表达规律及体外培养颗粒细胞中所选micro RNAs对FSH和LH的反应规律,初步探讨了其在腔前卵泡体外生长和颗粒细胞增殖、凋亡、周期和雌激素合成和分泌中的作用,检测并验证了参与调控p53、Chk1和SUMO-1表达的几种micro RNAs,并对Chk1/2在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制进行了研究。该研究结果将为进一步深入探讨micro RNAs如何通过调控p53、Chk1及SUMO-1表达而参与调控卵泡生长和闭锁、颗粒细胞增殖和凋亡及分化奠定重要理论基础,为理解哺乳动物卵泡发育、排卵和卵子成熟机制提供理论参考。