研究背景:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是院内获得性感染的重要条件致病菌,可以引起严重的、甚至致死性的感染如肺炎、泌尿系统感染和血流感染等,而且可造成一定程度的院内感染流行。由于广谱抗生素的广泛应用,铜绿假单胞菌对超广谱抗生素的敏感性不断在下降。多药耐药成了铜绿假单胞菌感染的一个严重的问题,近年来更是出现了对除了多粘菌素外的所有抗假单胞的抗生素包括青霉素类、头孢菌素、单酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和碳青酶烯类等抗菌药物同时耐药的菌株,即泛耐药铜绿假单胞菌(Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, PDRPA)。除多粘菌素外目前市面上有售的抗生素对其完全无效,患者一旦感染,往往使临床医师束手无策,病死率极高,造成极其严重的临床后果。显然,PDRPA感染已经成为临床医师所面临的日益严重且迫切需要解决的课题。对于泛耐药铜绿假单胞菌的形成机制,国内外学者进行了大量的研究。目前普遍认为,铜绿假单胞菌外膜低通透性和主动外排系统与菌株对部分抗菌药的固有耐药有关,而铜绿假单胞的一个重要特性是获得性耐药,这与产生灭活酶、主动外排系统高表达以及生物膜的形成有关。泛耐药铜绿假单胞菌的耐药机制是复杂的,可能是多种耐药机制的共同作用。但几乎可以确定的是,泛耐药铜绿假单胞菌耐药的形成与抗菌素的应用有明显的关系。长期的时间使铜绿假单胞菌暴露于多种抗生素之下是导致PDRPA出现的重要原因。然而对于深层次的抗菌药物如何使细菌形成这些耐药机制,则报道不多。目前知道抗菌药物应用与铜绿假单胞菌的耐药关系紧密。但抗菌药是如何作用使铜绿假单胞菌产生耐药?目前有两种观点,即:(1)竞争性抑制机制:抗生素应用通过施加选择性压力使耐药细菌增殖增加,体内竞争性菌群生长受到抑制。具体到某个患者的个体,选择性压力可以使细菌容易出现新的耐药突变或出现耐药菌既存的亚群。(2)适应性突变:细菌长时间暴露于抗菌药物之可以产生自身突变而形成耐药。国内有报道称以次抑菌浓度环丙沙星可诱导铜绿假单胞菌对其它喹诺酮类和非同类抗菌素之间的交叉耐药,次抑菌浓度亚胺培南亦可诱导PA耐药的发生。在铜绿假单胞菌耐药形成过程中,何者占主导地位,目前尚不明确。泛耐药铜绿假单胞是否也可以通过单纯抗菌药物的诱导而形成呢?目前尚未见报道。如果能够通过体外诱导的方法使敏感的铜绿假单胞菌株形成泛耐药菌株,那么对揭示临床分离的泛耐药铜绿假单胞菌的形成机制研究无疑具有重要的意义,可以指导临床铜绿假单胞菌感染的治疗。本研究拟通过体外多种药物诱导,使敏感的铜绿假单胞菌株转变为泛耐药的菌株,并进一步研究其耐药机制,从而揭示抗生素应用与泛耐药铜绿假单胞菌生成的关系,为临床铜绿假单胞菌感染的治疗提供理论支持。并进一步探讨联合抗菌药物体外诱导对铜绿假单胞菌的耐药性影响,以期对临床治疗有所帮助。目的通过多种抗菌药物体外诱导构建泛耐药铜绿假单胞菌体外模型,检测其相关的耐药机制;探讨联合抗菌药物体外诱导对铜绿假单胞耐药性的影响。方法1.所有菌株均经VITEK-2微生物分析仪鉴定,并用K-B纸片扩散法筛选出对临床常用六类抗菌药物包括抗假单胞菌性青霉素类、头孢菌素、单酰胺类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和氨基糖甙类和多粘菌素B的敏感的铜绿假单胞菌。用标准琼脂平板二倍稀释法测定其MIC值。2.采用梯度浓度琼脂平皿传代诱导法,将4株细菌接种在含初始药物浓度(1/4MIC)的M-H平板上连续传代5代后转入高一级浓度(1/2MIC),直至对该药产生耐药。然后进入第二种药物诱导,诱导药物依次为头孢他啶哌拉西林/他唑巴坦氨曲南环丙沙星亚胺培南/西司他丁丁胺卡那。诱导前后测定细菌的敏感性。3.采用E-test法对诱导前的敏感株和诱导的泛耐药菌株以及临床分离的泛耐药菌株进行MBL检测。4.采用Real-time PCR技术对诱导前的4株敏感铜绿假单胞菌和诱导后的4株泛耐药铜绿假单胞菌以及4株临床分离的泛耐药铜绿假单胞菌进行主动外排系统的检测,包括:MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM。5.用亚胺培南、环丙沙星、阿米卡星和头孢他啶单用或联合用药的方式,通过多步法诱导7株临床分离的铜绿假单胞菌敏感株产生耐药,连续培养5代。比较单药和联合用药诱导后各代的MIC值。结果1.经诱导后4株敏感铜绿假单胞菌对六类抗菌药物的敏感性下降,MIC明显升高。按照CLSI耐药折点4株菌株全部转变为泛耐药菌株。2. 4株临床分离的敏感铜绿假单胞菌株诱导前后MBL检测均为阴性;临床分离的4株泛耐药铜绿假单胞菌株MBL检测有2株为阳性,另外2株为阴性。3.诱导前的4株敏感铜绿假单胞菌,4个外排系统均无高表达;相对于诱导前,经过诱导成为泛耐药菌株之后,4株耐药诱导株均存在MexA-OprM外排系统高表达,有1株存在MexCD-OprJ和1株MexEF-OprN高表达,全部菌株均无MexXY-OprM高表达;在临床分离的泛耐药铜绿假单胞菌中,有1株所有4个主动外排系统均高表达,有1株只有MexAB-OprM高表达,另外三个外排系统无高表达,另外2株4个外排系统均无高表达。4.单药诱导48小时后,除含IPM和CIP浓度最高的平皿(4×MIC)中没有菌落生长,其余平皿均有菌落生长。联合用药诱导后,没有菌落生的平皿中含药物的浓度下降。细菌对诱导药物的MIC迅速升高,联合用药可以使铜绿假单胞菌对所诱导药物的MIC升高幅度减少,且第一个48小时最为明显。随着用药时间延长,联合用药的优势逐渐下降。结论1.在体外抗菌药物的压力下,敏感的铜绿假单胞菌可以经诱导变为泛耐药铜绿假单胞,耐药性稳定。2.体外诱导的泛耐药铜绿假单胞菌不产金属β-内酰胺酶,其耐药性的产生可能与主动外排泵有关,尤其是MexAB-OprM。3.体外联合抗菌药物诱导与单药诱导相比可以使铜绿假单胞菌的耐药性减低,但诱导时间延长联合用药并无优势,提示早期联合治疗是避免铜绿假单胞菌耐药加快的有效办法。