研究背景:复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）是指与同一性伴侣连续遭受不少于2次在妊娠20周前的胚胎（体重≤500g）丢失。随着中国育龄期女性平均生育年龄的推迟及二胎政策的开放,高龄、内分泌异常及经过辅助生殖技术助孕的女性的比例大幅度增加,RSA发生率逐年上升,是目前世界范围内重要的健康难题。RSA病因十分复杂,目前已知病因包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、凝血因素及免疫因素等,其中免疫因素是目前生殖免疫学研究的热点。经过系统性的病因筛查,仍有约30%患者病因不清,称为不明原因的复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA）。妊娠类似半同种异体移植,成功的妊娠需要母体免疫系统对胚胎携带的父系抗原实现免疫耐受。多数专家认为,T细胞免疫紊乱及功能失调是导致URSA的重要因素,但T细胞免疫耐受的机制尚不清楚。目前URSA的治疗方式以免疫调节为主,有研究认为低分子量肝素（Low molecular weight heparin,LMWH）具备免疫调节作用,能够改善URSA患者的妊娠结局,但相关免疫调节机制不明确。滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells,Tfh）是近来新发现的独立的T细胞亚群,在移植免疫反应、自身免疫性疾病及肿瘤免疫中均发挥重要作用。研究发现,妊娠后外周血Tfh百分比增加,然而URSA患者Tfh细胞含量显著超过健康妊娠妇女。我们猜测妊娠需要Tfh细胞的参与,但过量的Tfh细胞可能导致流产。目前关于Tfh细胞在URSA中的研究停留在细胞数量的检测,其与滋养细胞交互对话的具体机制还未见报道。外泌体（exosome）是从滋养细胞表面直接释放到循环中的膜结构的囊泡,其内包裹携带着许多信息分子,如蛋白质、脂类、糖类和核酸等,外泌体磷脂双层膜结构可保护其携带信息不被酶降解,使其稳定存在于外周血中,母体外周血外泌体能够携带一系列与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成和胚胎发育等生物过程相关的miRNA。本课题组前期研究发现,LMWH治疗后,URSA患者血清外泌体miR-18a-3p和miR-17-3p的含量发生显著变化,使其恢复至健康早孕水平。体外实验发现,LMWH可以改善滋养细胞的生物学功能。而miR-18a-3p和miR-17-3p属于mi-17-92基因簇,mi-17-92基因簇对Tfh细胞的分化及长期存活很重要。我们猜测LMWH可能通过改善滋养细胞功能,改变外泌体中相关miRNA的含量,从而改善URSA患者外周血异常Tfh水平。研究目的:本研究拟分三个部分:第一部分,研究健康妊娠妇女蜕膜及外周血CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞亚群随孕龄的变化。第二部分,比较早孕期的健康妇女、未经LMWH治疗的URSA妇女和LMWH治疗后的URSA妇女外周血Tfh细胞亚群百分比的变化;比较早孕期选择性终止妊娠的健康妇女与胚胎停止发育的URSA妇女蜕膜组织中Tfh细胞亚群百分比的差异。第三部分,LMWH改善URSA患者异常Tfh细胞水平的机制。研究方法:第一部分:1.通过蜕膜免疫细胞（decidua immune cells,DICs）提取及流式细胞技术,检测早孕期、中孕期、晚孕期和分娩前健康妇女外周血和蜕膜Tfh细胞亚群的百分比。选取健康妊娠妇女80例,根据孕周将80例研究对象分为4组:早孕组、中孕组、晚孕组和分娩前组,每组20例,流式细胞技术检测4组外周血CD4⁺CXCR5⁺Tfh占CD4⁺T细胞亚群的百分比;PD1^-ICOS⁺Tfh、PD1⁺ICOS⁺Tfh、PD1⁺ICOS^-Tfh和PD1^-ICOS^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺Tfh亚群的百分比;CXCR3^-CCR6⁺Tfh、CXCR3⁺CCR6^-Tfh和CXCR3^-CCR6^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺CD45RA^-Tfh的百分比。2.收集25例研究对象的蜕膜组织,其中选择性终止妊娠早孕健康妇女13例（D-早孕组）,剖宫产终止妊娠分娩前妇女12例（D-分娩前组）,提取DICs,流式细胞技术检测DICs中上述Tfh亚群的百分比。第二部分:1.通过DICs提取及流式细胞技术,检测蜕膜及外周血Tfh亚群的百分比。纳入60例早孕期妇女,其中30例健康妇女（对照组）,30例未使用LMWH治疗的URSA患者（URSA治疗前组）,经过LMWH治疗后,再次抽血检查（URSA治疗后组）,检测外周血Tfh细胞亚群的百分比。2.收集选择性终止妊娠健康妇女（D-对照组）和此次妊娠胚胎停止发育URSA妇女（D-URSA组）的蜕膜组织各10例,提取DICs,流式细胞技术检测DICs上述Tfh亚群的含量。RT-PCR技术检测D-对照组和D-URSA组蜕膜组织Tfh细胞相关分子mRNA表达量（CXCR5、Bcl-6、PD1、ICOS、CXCR3和CCR6）第三部分:1.收集早孕期未经LMWH治疗的URSA患者的外周血,提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）。使用浓度为0IU/ml、0.25IU/ml、0.5IU/ml、1.0IU/ml、2.0IU/ml、2.5IU/ml、5.0IU/ml的LMWH药物培养基培养PBMC,流式细胞技术检测培养前后Tfh细胞亚群的百分比。2.完全培养基培养HTR-8/SVneo细胞的上清（阴性对照组）和LMWH药物培养基处理HTR-8/SVneo细胞的上清（处理组）培养PBMC,流式细胞技术检测培养前后Tfh细胞亚群在PBMC中的百分比。3.鉴定HTR-8/SVneo细胞培养上清中的外泌体。纳米颗粒示踪分析技术鉴定外泌体粒径分布,Western blot鉴定外泌体标志蛋白CD63、CD81、ALIX和PLAP的表达,透射电镜观察外泌体形态。使用LMWH处理HTR-8/SVneo细胞的上清（Exo+组）、祛除外泌体的LMWH处理HTR-8/SVneo细胞的上清（Exo-组）和LMWH处理HTR-8/SVneo细胞上清中的外泌体（Exo组）分别培养PBMC,流式细胞技术检测培养前后Tfh细胞占PBMC中的百分比。使用完全培养基培养HTR-8/SVneo细胞的上清中的外泌体(Exo_{阴性对照组})和LMWH药物培养基处理HTR-8/SVneo细胞的上清中的外泌体(Exo_处理组)分别培养PBMC,流式细胞技术检测培养前后Tfh细胞占PBMC中的百分比。4.提取Exo_{阴性对照组}和Exo_处理组外泌体总RNA,RT-PCR检测两组miR-17-3p和miR-18a-3p的相对表达量。研究结果:第一部分:1、临床资料分析显示,研究对象一般资料具有可比性。2、随孕周进展,外周血CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞占CD4⁺T细胞的百分比逐渐升高（P=0.001）,PD1^-ICOS⁺Tfh与PD1⁺ICOS⁺Tfh占CD4⁺CXCR5⁺Tfh百分比随孕周进展显著下降（P<0.01）。PD1^-ICOS^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺Tfh百分比随孕周进展显著增加（P=0.005）。CXCR3^-CCR6^-占CD45RA^-CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞的百分比在晚孕期达峰值,分娩降至早孕水平（P<0.0001）。3.早孕蜕膜PD1⁺ICOS^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞的比例显著高于分娩前（P<0.0001）。早孕蜕膜PD1^-ICOS^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞的比例低于分娩前（P=0.0009）。CCR6^-CXCR3^-Tfh细胞占CD45RA^-CD4⁺CXCR5⁺Tfh百分比在分娩前蜕膜中的含量显著超过早孕期（P=0.0336）。第二部分:1、临床资料分析显示,研究对象一般资料具有可比性。2.URSA治疗前组外周血CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞占CD4⁺T细胞的百分比显著高于对照组（P=0.04）。URSA治疗后组外周血CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞占CD4⁺T细胞的百分比与对照组比较无显著差异（P=0.26）。URSA治疗前组外周血PD1⁺Tfh细胞占CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞的百分比与对照组比较显著升高（P=0.02）。外周血CCR6^-CXCR3⁺Tfh细胞占CD45RA^-CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞的百分比在对照组含量显著低于URSA治疗前组和URSA治疗后组（P=0.0138）。3.D-对照组蜕膜组织中CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞的百分比显著低于D-URSA组（P=0.006）。与D-对照组相比,D-URSA组PD1^-ICOS⁺Tfh和PD1⁺ICOS⁺Tfh占CD4⁺CXCR5⁺T细胞的百分比显著升高（P<0.05）。与D-对照组相比,D-URSA组CXCR3⁺CCR6^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺CD45RA^-Tfh细胞的比例显著升高（P=0.010）,CXCR3^-CCR6^-Tfh占CD4⁺CXCR5⁺CD45RA^-Tfh细胞的比例显著降低（P=0.002）第三部分:1.0IU/ml、0.25IU/ml、0.5IU/ml、1.0IU/ml、2.0IU/ml、2.5IU/ml、5.0IU/ml的LMWH药物培养基培养PBMC后,CD4⁺CXCR5⁺Tfh占CD4⁺T细胞的百分比无显著变化（P>0.05）。2.在阴性对照组和处理组上清培养后的PBMC中,处理组CD4⁺CXCR5⁺Tfh占CD4⁺T细胞的百分比、PD1⁺Tfh占CD4⁺CXCR5⁺Tfh的百分比和CXCR3⁺CCR6^-Tfh占CD4⁺CXCR5^-CD45RA^-Tfh的百分比显著下降（P<0.05）,阴性对照组上述细胞的百分比下降,但无显著统计学差异（P>0.05）。3.纳米颗粒示踪分析显示,外泌体粒径峰值为130nm,透射电镜显示外泌体呈现圆杯囊泡样结构,western blot显示外泌体表达CD81、CD63、ALIX和PLAP关键表面标志,上述外泌体特征值与理论外泌体特征相符。Exo+组和Exo组的条件培养基培养PBMC后,CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞和PD1⁺Tfh亚群含量显著降低（P<0.05）,Exo-组培养PBMC后,上述三种Tfh细胞亚群未发生显著变化（P>0.05）。Exo_{阴性对照组}和Exo_处理组培养PBMC后,Exo_处理组CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞和PD1⁺Tfh亚群含量显著下降（P<0.05）,Exo_{阴性对照组}未发生显著变化（P>0.05）。4.Exo_处理组外泌体miR-18a-3p的相对表达量显著超过Exo_{阴性对照组}（P<0.05）,miR-17-3p在两组间的相对表达量无显著差异（P>0.05）。研究结论:第一部分:PD1^-ICOS^-Tfh和CXCR3^-CCR6^-Tfh型Tfh细胞与妊娠中晚期免疫耐受的维持有关,PD1⁺ICOS^-Tfh细胞更倾向于调节早孕期免疫平衡。第二部分:URSA患者外周血和蜕膜CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞占CD4⁺T细胞百分比显著增加,尤其是PD1⁺Tfh和CCR6^-CXCR3⁺Tfh。LMWH可显著降低URSA患者异常Tfh细胞和PD1⁺Tfh细胞百分比。第三部分:LMWH可能通过改变滋养细胞分泌的外泌体miR-18a-3p的含量,进而影响URSA患者Tfh的数目及功能,对URSA患者发挥免疫调节作用,具体机制仍需继续研究。