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血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管壁的主要组成成分,维系着血管壁的结构和功能。VSMCs从中膜迁移到内膜下对内膜增厚程度及斑块的形成和稳定起至关重要的作用。内膜增厚是血管对各种损伤,如动脉粥样硬化形成、支架植入及球囊扩张等的反应。可以说没有VSMCs的迁移,就没有斑块的形成。热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)属于小分子热休克蛋白(the small heat shock protein ,sHSP)家族中的重要一员,其重要的生物学功能是保护细胞免受环境中自由基、热、缺血和毒性物质等各种应激因素导致的损伤,参与细胞的增殖分化、细胞凋亡的信号转导调节及微丝的稳定,是细胞迁移的关键调节因子。作为一种新的基因治疗方法,RNA干扰(RNA interference, RNA i)以其特异性、高效性成为研究的热点。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗中理想载体。为此,我们利用RNAi干扰技术,设计并合成针对自发性高血压大鼠HSP27基因的小干扰RNA片段,通过慢病毒转染VSMCs,观察其对VSMCs的增值及迁移作用的影响,以期为进一步研究HSP27功能及基因治疗奠定基础。本课题分为三部分。第一部分:自发性高血压大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定从Genbank获得HSP27基因序列。根据HSP27 mRNA序列,设计、合成三对带有BglⅡ、HindⅢ酶切位点、互补的靶向自发性高血压大鼠HSP27基因RNAi片段。磷酸化后退火,插入PSUPER-basic载体,产生含H1启动子并能够表达小发夹RNA(small hair,shRNA)的PSUPER-basic-HSP27载体质粒,分别命名为:PSUPER-basic-HSP27-1、PSUPER-basic-HSP27-2、PSUPER-basic-HSP27-3。将构建的PSUPER-basic-HSP27行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。初步鉴定正确的质粒载体送生物公司进一步测序鉴定。将三对鉴定正确的PSUPER-basic-HSP27中的HSP27 shRNA表达结构进行酶切,插入到慢病毒转移质粒pNL- IRES2-EGFP中,产生pNL-HSP27 -EGFP。再将三质粒pNL- HSP27- -EGFP, pHelper和VSVG共转染293T细胞,包装产生慢病毒。经超速离心收集病毒颗粒,转导293T细胞,测定慢病毒的滴度。结果显示: shRNA表达结构成功的插入pNL- -IRES2-EGFP质粒,产生能同时表达EGFP和转录产生HSP27 shRNA的慢病毒转移质粒pNL- HSP27.-EGFP-1、2、3。并包装出高滴度的病毒。病毒功能滴度为3.12X106TU/ml。第二部分:靶向自发性高血压大鼠热休克蛋白27基因的慢病毒对血管平滑肌细胞HSP27基因沉默作用采用组织贴块法分离、培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞,三天后,细胞伸出组织块。两周后,细胞呈典型的‘谷和峰’生长模式。Alpha Smooth Muscle Actin单克隆抗体免疫细胞化学染色可见胞浆内呈棕黄色丝状条纹,VSMCs阳性率为95%以上。以慢病毒感染VSMCs,然后使用Trizol抽提细胞总RNA,以实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RTQ-PCR)检测VSMCs HSP27 mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western-blotting,WB)检测VSMCs HSP27蛋白表达水平。结果显示:RTQ-PCR显示,三对互补片段均有不同程度的干扰效果,分别是:pNL-HSP27- EGFP-1:0.774;pNL-HSP27 -EGFP-2:0.711;pNL-HSP27- EGFP-3:0.43。Western blot检测显示,HSP27蛋白质条带位于27kD位置,慢病毒感染的VSMCs细胞组HSP27蛋白表达水平明显降低。以pNL-HSP27-EGFP- 1组的干扰效率最高,与实时荧光定量PCR结果相一致。第三部分:干扰自发性高血压大鼠热休克蛋白27基因对VSMCs细胞增殖、迁移的影响通过细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测VSMCs细胞增殖,使用AngII和PDGF-BB诱导VSMCs的HSP27磷酸化,用特异性的单克隆Phospho-HSP27抗体的蛋白免疫印迹法检测HSP27的活性,以FITC-鬼笔环肽标记F-actin,用激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的形态变化,采用改良的Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验。结果显示: pNL-HSP27-EGFP-1可显著抑制PDGF-BB、AngII诱导的细胞增殖,抑制率分别为30.8%(P<0.05)和26.1%(P<0.05)。PDGF-BB和AngII呈浓度依赖性诱导VSMCs的HSP27磷酸化,与对照组相比分别增加168.9%和198.9%(P<0.01),同时使VSMCs内F-actin数量明显增加,纵向平行排列,形成应力纤维丝。对AngII、PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化, pNL-HSP27-EGFP-1抑制率分别是66.1%和79.6%(P<0.01)。pNL-HSP27-EGFP-1能够显著抑制PDGF-BB、AngII诱导的VSMCs细胞迁移,抑制率分别为45.6%和40.0%(P<0.01)。结论:1、成功构建了能够表达HSP27小干扰RNA慢病毒载体质粒pNL-HSP27-EGFP。构建的pNL-HSP27-EGFP-1慢病毒载体能够高效、特异的沉默HSP27基因的表达。2、靶向HSP27基因的小干扰RNA则可以明显抑制AngII和PDGF-BB诱导VSMCs的生长、增殖。3、pNL-HSP27-EGFP-1显著抑制AngII、PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化。可能是pNL-HSP27-EGFP-1特异、高效的沉默了HSP27基因, HSP27的表达显著降低,从而使得AngII、PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化也相应的明显减少。4、靶向HSP27基因的小干扰RNA能显著降低PDGF-BB、AngII诱导VSMCs细胞迁移。可能是通过作用于控细胞迁移信号传导通路的最终共同通道或汇聚点。HSP27在细胞的迁移中起重要作用。