【背景】牙周疾病是牙周支持组织的慢性炎性疾病,其主要症状为渐进性的牙周附着丧失和的牙槽骨吸收,最终表现为牙齿的松动、脱落[1]。菌斑控制是整个牙周病治疗的基础,但目前的治疗手段仅能控制炎症的进一步发展,不能彻底治愈。牙撕脱性损伤是指牙齿受到外力撞击后由牙槽窝中脱出、同时牙周膜和牙髓被彻底撕脱的一类损伤,它是牙外伤中发生率较高的一类疾病,其治疗难度大且预后很不稳定。牙齿缺失又是人类常见的一类疾病,常由牙周病、龋齿、牙创伤等引起[2]。其治疗手段一般为可摘、固定义齿修复以及种植义齿修复。但可摘、固定义齿修复需要牙齿磨切,造成了二次损伤,且修复效果有限;而种植义齿修复虽然避免了牙齿磨切,但需要建立种植体与牙槽骨的骨性结合,缺乏天然牙周膜的封闭、支持、缓冲以及感知功能,故存在因合力过大或牙周感染导致骨吸收的风险,因此重建具有功能性牙周膜的组织工程牙根仍是口腔科学研究的目标之一[3,4]。如上所述,牙周病治疗,牙再植以及组织工程牙根的构建,均涉及由牙周膜、牙槽骨和牙骨质组成的牙周复合体(Periodontal complex)的重建。牙周复合体是由多种不同组织共同构成的一个良好的能够缓冲咬合应力的功能系统。牙周重建,涉及到牙根表面与牙槽骨硬骨板之间牙骨质、牙周膜和部分牙槽骨的重建;功能性的牙周膜愈合应该建立起牙周膜与牙骨质、牙槽骨之间的沙比纤维交联。如今,随着组织工程学的发展及牙周再生技术的进步,采用干细胞以及合适的生物材料重建牙周组织成为当下口腔医学研究的热点之一。牙周重建所涉及的种子细胞一般包括:牙周膜干细胞、牙囊细胞、骨髓间充质干细胞等。大量的文献报道证实,不同来源的干细胞虽然在体外诱导过程中仍显示出向多种组织分化的能力,但其各自的分化能力仍存在差异,且保留了向获取源组织分化的倾向性。如施松涛等[5]发现牙周膜细胞与骨髓间充质干细胞存在分化差异,与HA复合移植裸鼠皮下8周后发现,前者更易分化为牙骨质、牙周膜样组织,而后者基本为骨样组织。本研究依据多能细胞分化倾向性的不同,不同于以往经常采用单种种子细胞进行牙周重建,拟采用具有不同分化倾向性的种子细胞即牙周膜干细胞(PDL stem cells(PDLSCs))和和骨髓间充质干细胞(jaw bone MSCs(JBMSCs)),以实现牙周复合体的重建。一般情况下,利用组织工程方法进行牙周再生,除细胞外还需要支架材料以及多种生长因子的参与,形成一种具有复杂调控网络的合适的微环境,以促进种子细胞的粘附、增殖以及分化功能。细胞膜片技术(cell sheet engineering)是将种子细胞在一定条件下进行连续培养,诱使其形成多层细胞,同时使种子细胞在短时间内形成大量细胞外基质的技术。其中丰富的细胞外基质成分大大提高了种子细胞定向植入的成功率,又可以最大限度的发挥干细胞的生物学功能。此外,细胞膜片中丰富的胶原基质可以视为一种自源性的支架材料,其结构内富含大量的结构蛋白和特殊蛋白为种子细胞发育提供了良好的微环境[6]。富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)是通过新鲜自体血一次性离心制备而成富含血小板的胶冻状物,压成膜后形成一种富含各种生长因子的纤维蛋白支架结构,其中各种生长因子间具有天然的配比,其含量一般为全血3-8倍,目前已经安全应用于临床[7]。本研究以牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞作为种子细胞的来源,以两种细胞膜片中富含的细胞外基质以及PRF中丰富的纤维蛋白作为支架材料的来源,以PRF中缓释的具有天然配比的自体生长因子作为生长因子的来源,构建了PDLSC sheet/PRF/JBMSC sheet复合体结构以实现牙周复合体的再生。为了验证以上的假说,我们首先在细胞层面、细胞膜片层片比较了这两种干细胞的不同分化倾向性,然后鉴定PRF中主要生长因子的缓释特性以及其对两种干细胞增殖、分化的影响,最后我们制备了裸鼠异位移植模型加以验证。通过制备表面脱矿的根形牙本质支架(treated dentin matrix(TDM))来模拟牙根界面的形态和微环境,制备由HA/TCP(hydroxyapatite(HA)/tricalcium phosphate(TCP))构成的根形支架来模拟牙槽骨界面的形态和微环境,将TDM插入根形的HA/TCP支架后,两者之间形成1mm左右的间隙,模拟牙周缺损间隙。然后我们将PDLSC sheet/PRF/JBMSC sheet复合体结构移植入模拟的牙周缺损间隙,然后整体移植入裸鼠背部皮下,实验8w后取材,检测组织再生的情况。考虑到牙周复合体是一种包含多种组织的复合体结构,PDLSC细胞膜片/PRF/JBMSC细胞膜片复合设计或许可以为牙周复合体的再生提供一种新的、适合的方案。本课题的研究内容如下:第一部分人牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞的培养与鉴定【目的】对人的PDLSCs和JBMSCs进行体外分离、培养和鉴定,并在细胞层面分析两种干细胞的不同特性。【方法】采用组织块联合酶消化法分离培养来自前磨牙根中段1/3的PDLSCs,采用冲洗法培养来自颌骨骨髓中的JBMSCs。将两种细胞同时进行如下检测:干细胞表面标志物检测(STRO-1、CD29、CD146、CD23和CD45);通过克隆形成实验检测其克隆形成能力;采用CCK-8法检测7d内细胞增殖曲线;通过体外成脂、成骨诱导分化,检测其分化特性;分别与HA/TCP颗粒混合后进行裸鼠皮下移植,检测其异位成骨能力;采用Real-time PCR法检测P2代的两种干细胞的基因表达差异。【结果】PDLSCs表达更高的CD146阳性标志物,其余标志物的表达未见明显统计学差异;PDLSCs具有更强的克隆形成能力以及增殖能力;JBMSCs具有更好的体外诱导成脂、成骨能力。异位移植实验结果表明:PDLSCs组等效骨密度值为430.4 mg/cc,而JBMSCs组等效骨密度值为615.8 mg/cc,两者相比有明显的统计学差异(P<0.05)。H&E染色结果显示:PDLSCs组新生组织为大量的牙周膜样组织以及少量的牙骨质样组织;而JBMSCs组新生组织为大量的骨样组织以及少量的纤维样组织。Real-time PCR检测结果表明:JBMSCs表达水平较高具有统计学差异的基因包括:与细胞干性相关的基因(nanog),与细胞粘附相关的基因(纤维粘连蛋白fibronectin、层粘连蛋白laminnin),以及成骨相关的基因(I型胶原col-I、III型胶原col-III、骨膜蛋白periostin、骨涎蛋白bsp、骨桥蛋白opn和runx2);PDLSCs表达水平较高的基因为牙骨质形态蛋白(cemp-1)基因;在表达水平上无明显的统计学差异的基因包括细胞干性相关基因notch-1和牙骨质附着蛋白(cap)基因。【结论】(1)成功地分离人的PDLSCs和JBMSCs;PDLSCs表达更高的细胞表面阳性标志物CD146;与JBMSCs相比,PDLSCs具有更强的克隆形成能力以及增殖能力。(2)与PDLSCs相比,JBMSCs表现出更强的体外成脂、成骨分化能力;异位移植实验证实PDLSCs倾向于在体内分化为牙骨质-牙周膜样组织,而JBMSCs倾向于分化为骨样组织。(3)P2代的PDLSCs的基因表达与JBMSCs有明显差异。原始基因的表达差异可能导致了两种干细胞不同的增殖、分化能力。第二部分:人骨髓基质干细胞与牙周膜干细胞膜片的制备与鉴定【目的】利用富含Vc的膜片诱导液诱导人PDLSC sheet和JBMSC sheet,并在细胞膜片层面分析两种干细胞膜片不同特性。【方法】配置含有50μg/m L Vc的膜片诱导液,将人的PDLSCs和JBMSCs连续诱导14 d后形成PDLSC sheet、JBMSCsheet,通过倒置显微镜、扫描电子显微镜观察其表面形貌;通过H&E、免疫组化染色对其细胞外基质进行鉴定;通过Real-time PCR、Western blot技术手段检测膜片中相关基因、蛋白的表达情况。【结果】成功制备人的PDLSC sheet和JBMSCsheet;同一时间段(14 d)诱导的PDLSC sheet包含较多的细胞层(3-7层),分泌更多的细胞外基质,膜片较厚;JBMSC sheet包含较少的细胞层(2-4层)。Real-time PCR检测结果显示:与PDLSCs(P2代)相比,PDLSC sheet表现出以下基因的高水平表达:牙周膜组织相关基因(col-I、col-III和periostin),成骨相关的基因(runx2、bsp、opn和ocn)和成牙骨质相关基因cemp-1,以及细胞粘附相关基因(fibrinectin和laminnin)。与JBMSCs(P2代)相比,JBMSC sheet表现出以下基因的高水平表达:矿化相关的基因(runx2、bsp、opn和ocn),牙周膜组织相关基因(col-I和col-III)的表达,以及细胞粘附相关基因(fibrinectin和laminnin)。此外,通过Western-blot技术比较了PDLSC膜片和JBMSC膜片的相对蛋白表达,该结果与Real-time PCR的结果基本一致。总体来说,与矿化相关的蛋白(COL-III、OPN和OCN)在JBMSC膜片组呈明显的上升表达趋势,而COL-I和CAP蛋白的表达水平在两种细胞膜片中无明显差异。免疫组织化学染色结果显示,PDLSC和JBMSC两种细胞膜片均强阳性表达COL-I和Fibronectin,均未见显著性差异;ALP在JBMSC sheet的表达量稍强于PDLSC sheet。【结论】(1)成功制备人的PDLSC sheet和JBMSC sheet;与JBMSC sheet相比,PDLSC sheet成膜片速度更快,同期内分泌更多的细胞外基质。(2)Real-time PCR结果证实,两种干细胞被诱导成细胞膜片后相关基因的表达发生了巨大的变化,在本实验中,几乎所有的检测基因表现出上调的表达趋势。例如,分别与P2代干细胞相比,PDLSC sheet和JBMSC sheet均表现出牙周组织特异性基因(col-I和col-III),矿化相关基因(runx2,bsp,opn和ocn)以及细胞粘附相关基因(fibrinectin和laminnin)的上调表达。该实验结果说明,在目的基因表达的层面上,对于牙周复合体的再生,细胞膜片相较于离散的细胞更有优势。(3)Real-time PCR以及Western-blot结果证实,PDLSC sheet和JBMSC sheet之间的基因表达差异较大:JBMSC sheet表现出矿化相关基因(opn和ocn),粘附相关基因(fibrinectin和laminnin),以及col-III和periostin的上调表达;但cemp-1表达水平较PDLSC sheet低;两种膜片间col-I和cap的表达未见明显差异。该结果表明,PDLSCs和JBMSCs之间的基因表达差异从细胞层面持续到细胞膜片层面,而且这种基因以及蛋白表达的差异将最终影响到再生组织的结构和功能。第三部分釉基质蛋白强化的牙周膜干细胞膜片的制备与鉴定【目的】通过第二部分的实验分析,我们发现相比较离散的单个种子细胞,细胞膜片是一种更好的细胞应用载体。考虑到牙周复合体再生过程涉及到多种不同软硬组织的重建,因此探索一种具有多向分化潜能、且质量更佳的牙周膜细胞膜片非常必要。釉基质蛋白(enamel matrix derivative,EMD)已经被FDA批准应用于临床中牙周缺损的再生治疗之中,且被证实可以诱导牙周膜以及牙骨质的形成,因此本实验探索一种釉基质蛋白强化的新型牙周膜干细胞膜片,并对其分化潜能进行鉴定。【方法】人PDLSCs的分离、培养;采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测含0、25、50、100μg/m L EMD的完全培养液对PDLSCs细胞毒性影响;采用CCK-8法检测含不同浓度EMD的完全培养液对PDLSCs增殖的影响;以50μg/m L Vc和100μg/m L EMD浓度配置EMD强化的膜片诱导液,然后以此诱导EMD强化的牙周膜干细胞膜片;通过倒置显微镜、SEM和HE染色观察膜片表面以及横断面形态特点;通过Real-time PCR和免疫组化法检测基因和蛋白的表达情况;将两种诱导好的干细胞膜片分别进行为期14d的体外成骨诱导分化,检测两种细胞膜片的矿化能力。【结果】0、25、50、100μg/m L的EMD对于PDLSCs的细胞毒性无显著性差异(P>0.05);不同浓度的EMD对于PDLSCs的增殖作用显示出剂量依赖效应,在第3d和第5d时,50、100μg/m L的EMD组相较其它组具有更多的增殖细胞数量(P<0.01);采用含50μg/m L Vc和100μg/m L EMD的膜片诱导液成功地诱导出EMD增强的PDLSC膜片;通过大体观察发现,EMD增强的PDLSC膜片比常规诱导的PDLSC膜片更厚,质地更致密;通过倒置显微镜和SEM观察发现,EMD增强的PDLSC膜片表面形成散在的EMD蛋白聚集体;根据HE染色和SEM的横断面观察结果,EMD增强的细胞膜片包含更多层细胞,分泌更丰富的ECM以及形成了更致密连接的胶原纤维网;免疫组化结果显示,EMD增强的细胞膜片和常规诱导的细胞膜片均呈现COL-I的强阳性染色,而ALP和CAP在EMD增强的细胞膜片的表达均略强于常规诱导膜片;EMD增强的PDLSC膜片表现出以下基因不同的程度的上调表达,包括:成牙周膜相关基因(col-I,periostin),成骨相关基因(runx2,opn,ocn)以及成牙骨质相关基因(cap);体外矿化诱导实验证实,EMD增强的细胞膜片显示出更强的ALP活性,以及更多的矿化结节形成。【结论】利用50μg/m L Vc和100μg/m L EMD成功地诱导了EMD增强PDLSC sheet;向完全培养液添加100μg/m L的EMD后促进了PDLSCs的增殖以及PDLSC sheet中ECM的分泌;Real-time PCR结果证实EMD强化的细胞膜片促进了成牙周膜、成骨以及成牙骨质相关基因的上调表达;EMD强化的细胞膜片在体外矿化诱导2 w时显示出更强的成骨矿化能力。第四部分PDLSC细胞膜片/PRF/JBMSC细胞膜片复合结构用于牙周复合体再生的研究【目的】以PDLSC sheet和JBMSC sheet作为种子细胞的来源,以PDLSC sheet和JBMSC sheet富含的细胞外基质以及PRF中丰富的纤维蛋白作为支架材料的来源,以PRF中缓释的具有天然配比的自体生长因子作为生长因子的来源。构建PDLSC细胞膜片/PRF/JBMSC细胞膜片复合结构,然后在裸鼠异位移植模型中验证其能否用于牙周复合体的再生。【方法】PRF制备及观察;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测PRF中各种生长因子在7d内的释放量;采用Transwell小室的方法检测不同浓度的PRF诱导PDLSCs和JBMSCs的迁移效果;采用细胞计数法检测不同浓度的PRF对两种干细胞增殖的影响;通过Real-time PCR法检测两种干细胞膜片分别与PRF共培养后基因的表达情况;制备表面脱矿的根形牙本质支架(TDM)来模拟牙根界面的形态和微环境,制备由HA/TCP构成的根形支架来模拟牙槽骨界面的形态和微环境,将TDM插入根形的HA/TCP支架后,两者之间形成1mm左右的模拟的牙周缺损间隙。此时我们将PDLSC sheet/PRF/JBMSC sheet复合体结构移植入此间隙,然后整体移植入裸鼠背部皮下,实验8周后取材,进行HE,马松三色以及COL-I免疫组化染色,检测牙周复合体组织的再生情况。【结果】新鲜制备的PRF上部白色区域主要为粗细不等的纤维蛋白形成网络结构,而下部红色区域含有密集堆积的血小板以及一些嵌入纤维蛋白结构的红细胞和白细胞等;PRF中各种生长因子的释放特点呈现时间依赖效应,在前3天存在突释现象,随时间延长,其释放量递减;1/16~1/2 PRF均可以促进两种干细胞的迁移,但表现出剂量依赖效应。对于PDLSCs的迁移效果分析发现,1/16PRF组较其它各组诱导细胞迁移效果更佳(p<0.01)。对于JBMSCs的迁移效果分析发现,1/4PRF组较其它各组诱导细胞迁移效果更佳(p<0.01);与对照组相比,1/8、1/4、1/2 PRF组均不同程度地促进了PDLSCs和JBMSCs的增殖,PRF促进细胞增殖的能力与剂量无明显正相关关系(P>0.05);关于PRF对两种干细胞基因表达的影响,分别与P2代cells组相比,cell sheet组均表现出粘附、矿化相关基因等几乎所有基因的上调表达;而cell sheet/PRF组几乎抑制了所有与粘附、矿化相关基因的上调表达,与P2代cells组相比,cell sheet/PRF组除cemp-1(P<0.05)以及runx2(P<0.05)外,其余基因的表达未发现明显差异(P>0.05);硬组织切片结果表明,在PDLSC膜片/PRF/PDLSC膜片组,可见大量同向排列的胶原纤维形成,同时可观察到丰富血管组织的形成,然而该组未发现明显的骨样组织的形成。在JBMSC膜片/PRF/JBMSC膜片组,可见丰富的连续的骨样组织形成,同时可观测到穿插其中的新生血管形成。在PDLSC膜片/PRF/JBMSC膜片组,检测到一种PDL/骨样复合体组织的形成,该结构在一定程度上类似于牙周复合体结构。即在TDM表面,我们观测到了牙骨质-牙周膜样组织的形成,外层靠近HA/TCP侧,观察到连续的骨样组织的形成。新生的组织互相嵌合紧密,形成有序的排列,并观察到新生血管组织穿插其中。【结论】成功地设计PDLSC膜片/PRF/JBMSC膜片复合结构中;q PCR结果证实:PRF可以抑制与之接触的中间部分细胞膜片的过度矿化,同时发挥了促进两种干细胞增殖的作用,在理论上支持了中间部分膜片向牙周膜样组织分化;裸鼠皮下移植8w后,PDLSC膜片/PRF/PDLSC膜片形成的组织类型主要为牙周膜样结构,JBMSC膜片/PRF/JBMSC膜片主要为骨样结构,而在PDLSC膜片/PRF/JBMSC膜片组形成了一种牙骨质/PDL/骨样组织,三种组织有序排列,互相嵌合,该结构在一定程度上类似于牙周复合体结构。该研究结果进一步验证了以下观点:特定组织来源的干细胞倾向于向获取源组织的结构和功能方向分化。考虑到牙周复合体是一种包含多种组织的复合体结构,PDLSC细胞膜片/PRF/JBMSC细胞膜片复合设计或许可以为牙周复合体的再生提供一种新的、适合的方案。