研究背景：　　随着社会经济的发展、生活质量的提高、妇女寿命的延长，女性盆底功能障碍性疾病（plevic floor disfunction，PFD）已经成为一个全球性的健康问题，严重影响了女性的生活质量，而治疗过程中对医疗资源的需求也对个人经济及社会经济造成了沉重的负担。　　盆底器官脱垂（pelvic organ prolapse，POP)是女性盆底功能障碍性疾病的主要病症之一，而有关POP发生的病理生理学机制还不是十分清楚。多数国内外研究资料表明，盆底支持组织主要是由胶原纤维和平滑肌细胞组成，而成纤维细胞是分泌胶原成分的主要细胞。在POP患者中，成纤维细胞功能的改变及胶原蛋白成分的下降已得到实验证实，恢复阴道成纤维细胞的功能或寻找能够代替阴道成纤维细胞的干细胞治疗POP是一个新的治疗手段。　　脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）属于间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs），具有来源丰富、取材方便、容易培养、多向分化潜能、自体移植或同种异体移植后免疫源性低等特性，是应用于再生组织工程的良好的种子细胞。多项研究表明，ADSCs能够促进皮肤创伤的愈合，其机制主要为增加胶原蛋白的含量及促进邻近组织中成纤维细胞的增殖，这为ADSCs应用于POP的治疗提供了理论基础。　　国内外大量实验证实体外不同的微环境下ADSCs的增殖及分化均会受到影响，结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）是一多肽类生长因子，主要存在于间质组织内，可促进多种细胞增殖、分化，及分泌细胞外基质（extracellular matrix,ECM）。在我们前期实验中已证实重组人CTGF能够抑制大鼠ADSCs向成脂细胞、成骨细胞分化并促进I型胶原蛋白及III型胶原蛋白mRNA的表达，但对大鼠ADSCs增殖及胶原蛋白合成的影响还需进一步研究。　　雌激素通过增加细胞外基质蛋白合成、降解受损的胶原蛋白参与维持盆底支持系统的结构完整性及稳固性，雌激素缺乏是POP发生的危险因素之一，在POP患者中，雌激素水平及雌激素受体均有不同程度的下降。雌激素能够促进骨髓间充质干细胞、皮肤成纤维细胞等的增殖，传统的雌激素替代治疗能够增加I型、III型胶原蛋白的表达，局部应用雌激素能够增加皮下组织胶原蛋白的含量及增加阴道壁黏膜的厚度，不同雌激素浓度能够影响ADSCs的向成骨细胞分化等，均得到试验证实。因此，了解不同浓度雌激素对ADSCs增殖及胶原蛋白合成的影响，能够为ADSCs用于治疗绝经后POP患者是否应局部加用雌激素提供实验依据。　　第一部分重组人CTGF对大鼠ADSCs增殖及胶原蛋白合成的影响　　研究目的：　　在前期研究的基础上，进一步了解重组人CTGF对大鼠ADSCs增殖及I型胶原蛋白、III型胶原蛋白合成的影响。　　研究方法：　　1.复苏第3代大鼠ADSCs，分别以空白对照组（CTGF的浓度为0 ng/ml）及CTGF的浓度为100 ng/ml的细胞培养基连续培养细胞1周，用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）法检测细胞的增殖，masson染色法检测细胞的生长形态及胶原蛋白的分泌情况。　　2.复苏第3代大鼠ADSCs，分别以空白对照组（CTGF的浓度为0 ng/ml）及CTGF的浓度为100 ng/ml的细胞培养基连续培养细胞1周、2周、3周、4周后，采用蛋白质免疫印迹（western blot）法分别检测I型胶原蛋白及III型胶原蛋白合成的变化。　　研究结果：　　1.第3代大鼠ADSCs的形态特征：复苏后的第3代大鼠ADSCs形态均一，呈类成纤维细胞形态，增殖能力好，接种后2-3天已铺满瓶底的80％-90%。　　2. MTT法检测结果：在重组人CTGF的作用下，大鼠ADSCs的增殖速度增加，在连续培养6天时，处理组中细胞OD570值为0.5763±0.0344，而对照组为0.4713±0.0624，有明显的统计学差异，P<0.05。　　3. Masson染色结果：大鼠ADSCs经Masson染色后，细胞核椭圆形，位于胞浆中央，染成蓝褐色；胞浆丰富，染成蓝色。处理组与对照组相比，胞体的长梭形态更明显，排列更加紧密。　　4. western blot结果显示在重组人CTGF的作用下，大鼠ADSCs I型胶原蛋白的合成较对照组增加，在连续培养1周、2周、3周、4周时，I型胶原蛋白的灰度值与β-actin的比值分别为0.761±0.041、0.834±0.115、0.721±0.105、0.774±0.180，而对照组中分别为0.679±0.029、0.708±0.061、0.714±0.010、0.720±0.026，两组各时间点相比有统计学差异，P<0.05；处理组中III型胶原蛋白的合成受到抑制。　　研究结论：　　第3代大鼠ADSCs复苏后增殖能力强，重组人CTGF能够促进大鼠ADSCs的增殖，并增加I型胶原蛋白的合成，抑制III型胶原蛋白的合成。　　第二部分17β-雌二醇对大鼠脂肪源性干细胞增殖及胶原蛋白合成的影响　　研究目的：　　了解雌激素对大鼠ADSCs增殖及I型胶原蛋白、III型胶原蛋白mRNA表达及合成的影响，为雌激素联合ADSCs用于治疗绝经后POP提供实验数据。　　研究方法：　　1.分别以空白对照组（17-β雌二醇的浓度为0 mol/L）及17-β雌二醇终浓度分别为10-7、10-8、10-9、10-10、10-11 mol/L的细胞培养基培养第3代大鼠ADSCs1周，用MTT法检测细胞的增殖。　　2.分别以空白对照组（17-β雌二醇的浓度为0 mol/L）及17-β雌二醇终浓度分别为10-7、10-8、10-9、10-10、10-11 mol/L的细胞培养基培养第3代大鼠ADSCs1周、2周、3周后，采用荧光定量PCR相对定量的方法及蛋白质免疫印迹（western blot）法分别检测I型胶原蛋白及III型胶原蛋白mRNA及蛋白表达的变化。　　研究结果：　　1. MTT法检测结果：各组细胞的生长曲线均呈“S”型，不同浓度的17-β雌二醇培养大鼠第3代ADSCs后，均能促进细胞的增殖，当17-β雌二醇的浓度为10-9 mol/L时，大鼠ADSCs的增殖速度最快，与对照组相比有明显的统计学意义，P<0.05。　　2.不同浓度的17β-雌二醇对大鼠ADSCs I型胶原蛋白mRNA及蛋白表达的影响　　（1）荧光定量PCR结果：不同浓度的17β-雌二醇对大鼠ADSCs I型胶原蛋白mRNA的表达有促进作用，当17β-雌二醇的浓度为10-9 mol/L时，大鼠ADSCs的I型胶原蛋白mRNA的表达量1周时约为对照组的1.4倍，2周时约为2.7倍，差别具有统计学意义，P<0.05。　　（2）western blot结果：不同浓度的17β-雌二醇对大鼠ADSCs I型胶原蛋白的合成有促进作用，当17β-雌二醇的浓度为10-9 mol/L时，大鼠ADSCs的I型胶原蛋白的灰度值与β-actin的比值1周时为1.2351±0.0148，2周时为1.3934±0.3807，而对照组中1周时为0.7484±0.0373，2周时为1.0499±0.2822，差别具有统计学意义，P<0.05。　　3.不同浓度的17β-雌二醇对大鼠ADSCs III型胶原蛋白mRNA及蛋白表达的影响　　（1）荧光定量PCR结果：不同浓度的17β-雌二醇对大鼠ADSCs III型胶原蛋白mRNA的表达有促进作用，当17β-雌二醇的浓度为10-9mol/L时，大鼠ADSCs的III型胶原蛋白mRNA的表达量1周时约为对照组的1.8倍，2周时约为3.4倍，差别具有统计学意义，P<0.05。　　（2）western blot结果：不同浓度的17β-雌二醇对大鼠ADSCs III型胶原蛋白的合成有促进作用，当17β-雌二醇的浓度为10-9mol/L时，大鼠ADSCs的III型胶原蛋白的灰度值与β-actin的比值1周时为0.5959±0.0839，2周时为0.7948±0.0241，而对照组中1周时为0.4528±0.1177，2周时为0.5215±0.1246，差别具有统计学意义，P<0.05。　　研究结论：　　17β-雌二醇能够促进大鼠ADSCs的增殖，增加大鼠ADSCs合成及分泌I型胶原蛋白和III型胶原蛋白。