目的:氧化应激指体内氧化和抗氧化失衡引起的生理生化过程,近年来研究认为氧化应激参与了哮喘的发生发展,是导致重症哮喘发生的重要原因之一,能够引起细胞DNA损伤。作为胞内修复蛋白8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶,主要受氧化应激调节,其表达特异性,表达量的多少以及与氧化损伤的程度的关系尚有许多疑问。本实验着重哮喘患者外周血单个核细胞,探讨8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(简称:OGG1)在哮喘患者外周血单个核细胞中的表达与氧化应激相关性和DNA氧化损伤情况。方法:收集2011.2-2011.12泸州医学院附属医院呼吸内科就诊的哮喘患者16例,按照GINA(全球哮喘防治创议)标准诊断程序明确支气管哮喘诊断,按照 GINA指南急性发作期严重程度分级分为轻中度哮喘组,重症哮喘组,正常人作为对照。所有研究患者均处于急性发作期,对照组为健康体检者。分别抽取外周静脉血,分离血清备用;淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)备用。分别用荧光探针DCF-DA和DHE标记测量各组中胞内平均荧光强度,并用WST法测量外周血血清中SOD表达,检测体内氧化应激情况;同时取外周血单个核细胞做单细胞凝胶电泳实验,检测其外周血单个核细胞中DNA损伤情况;为测量外周血单个核细胞胞内蛋白 OGG1表达使用间接荧光免疫方法流式细胞仪测量,并在激光共聚焦观察细胞形态。同理,运用间接荧光免疫检测外周血中单个核细胞胞内的转录活化因子NF-κB表达。结果均使用SPSS13.0软件统计软件,结果以均数±标准差( sx±)表示。组间比较采用q检验,相关分析采用直线相关分析;以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.研究对象一般情况观察:用药前,轻中患者组均能闻及哮鸣音,3例可闻及少许湿罗音,3例出现口唇发绀,吸氧前SpO2为54-95％,吸氧后血气提示均无呼吸衰竭。而重症组呼吸困难均明显,口唇发绀,端坐呼吸。5例患者烦躁不安,3例出现呼吸极度困难,双肺大量哮鸣音和较多湿罗音。吸氧前SpO2均小于89％。SPO2为43-84％,吸氧后血气提示有Ⅱ型呼吸衰竭。所有患者体温均正常。2.荧光探针DCFH-DA标记外周单个核细胞平均荧光强度:流式细胞仪结果显示,轻中度和重症组平均荧光强度分别为(37.81±11.67,65.8±19.27),与正常对照组平均荧光强度相比(10.90±3.01)明显增高,差异均有统计学意义。在重症哮喘患者平均荧光强度明显高于正常组 P=0.002,与轻中度哮喘相比荧光强度也明显增强P=0.046;酶标仪测量结果显示:OD值在轻中组和重症组与对照组相比,增高倍数为(1.29±0.38,2.67±1.13);重症组与轻中度组相比亦明显增高,P=0.00139,差异有统计学意义。轻中度组较正常组明显增强 P=0.011,差异具有统计学意义。细胞离心后,激光共聚焦下观察,轻中组和重症组平均荧光强度分别为(15.63±5.82,35.56±16.15),与正常对照组(6.08±6.11)荧光强度明显增高。P值分别为0.019,0.003。重症组与轻中度相比,P=0.029,差异具有统计学意义。同理用DHE探针标记测量胞内ROS激光共聚焦下观察,轻中组和重症组平均荧光强度分别为(16.70±14.95,33.52±15.58),与对照组荧光强度(2.20±1.47)相比明显增强。重症组与轻中组比较,P=0.002,轻中度与正常组相比,P=0.00036。差异具有统计学意义荧光强度明显增强。3.DNA损伤情况(单细胞凝胶电泳激光共聚焦下测定DNA拖尾长度):用单细胞凝胶电泳的方法检测外周单个核细胞 DNA损伤情况,图像用cometscore软件分析尾长,轻中组,重症组尾长分别为(22.27±22.26,99.12±90.97,),明显长于对照组(0.70±0.62),差异具有统计学意义(p<0.05)。重症哮喘组彗星实验拖尾最长,轻中组长于正常组。重症哮喘与正常组和轻中组相比,尾长更长 p<0.05,轻中度组尾长长于正常组p<0.05。4.外周单个核细胞OGG1表达水平:采用间接荧光免疫流式细胞仪检测,OGG1阳性表达流式结果显示轻中度,重症哮喘组阳性表达率分别为(26.29±16.17,51.95±19.10),与对照组(10.17±9.05)相比较表达率明显增高,p<0.05,差异具有统计学意义。重症哮喘组与轻中度哮喘组相比表达明显增加 p=0.003,轻中度与正常组比较P=0.048。激光共聚焦下观察细胞内OGG1表达在轻中度哮喘组,重症哮喘平均荧光轻度分别为(12.15±2.67,24.23±10.25),与正常对照组(3.52±3.76)相比明显增高。重症哮喘组与轻中度组合正常人相比,P值分别为0.036,0.0014。5.酶标仪测量血清中SOD水平显示:采用了目前测定SOD方法中WST-1法检测血清中SOD水平,发现在SOD在正常组,轻中组,重症组分别为(0.39±0.1,0.22±0.03,0.15±0.03),正常组比轻中组高,P,=0.004,与重症组相比,P=0.00038,结果具有统计学意义。在重症组中SOD比轻中度数值低,但不具有统计学意义。6.外周血单个核细胞 NF-κB:间接荧光免疫方法,激光共聚焦下观察外周血单个核细胞 NF-κB表达,在正常组,轻中组和重症组平均荧光强度分别为(重症组中平均荧光强度分别为(4.49±2.47,14.09±6.07,24.9±8.82),哮喘组较对照组明显增高。P<0.05,有统计学意义。结论:1、哮喘患者外周血单个核细胞内ROS水平明显增高,血清中SOD水平明显下降。表明:①氧化应激参与了哮喘的发生发展,在哮喘疾病发病机理中占有重要的作用。②哮喘疾病严重度与氧化应激相关。2、哮喘患者外周血单个核细胞存在有DNA损伤。特别是重症哮喘。疾病严重程度和DNA损伤有密切关联。3、OGG1表达在哮喘患者明显增高,特别是DNA损伤最为严重的重症哮喘。说明在DNA损伤时候,哮喘患者体内存在有DNA的修复。损伤越重,修复越多。4哮喘患者外周血单个核细胞内OGG1表达与ROS呈现正相关性,间接证实ROS可以导致DNA氧化损伤;氧化损伤越重,DNA损伤越多。